华韵的Calcein AM细胞活性检测试剂盒(Calcein AM Cell Viability Assay Kit)是一种通过Calcein-AM荧光探针标记活细胞从而简单、快速、灵敏、准确地用于细胞活性、细胞毒性或细胞增殖检测的试剂盒。本试剂盒由于能用于活细胞的精确定量，也被称为细胞荧光计数试剂盒(Cell Fluorescence Counting Kit)，简称Cell Fluorescence Counting Kit-F、CCK-F或CCKF。
本试剂盒检测速度快，仅需约30分钟即可完成细胞活性检测。
本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽。本试剂盒可检测低至50个活细胞，并且在50-50,000个细胞范围内有很好的线性关系。对于不同的细胞线性范围略有差别。
本试剂盒通常推荐使用荧光酶标仪进行定量检测，也可以使用流式细胞仪进行定量检测。如果有必要，也可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行细胞的荧光检测。
Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名称为钙黄绿素AM或钙黄绿素乙酰氧基甲酯)，是一种可渗透进入细胞、常用于测定真核细胞活力或线粒体通透性转换孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的绿色荧光探针，近年来也被广泛用于细胞活性、细胞毒性或细胞增殖的检测。
Calcein AM是在Calcein (钙黄绿素)的基础上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基团，加强了疏水性，因此能够很容易穿透活细胞膜，进入细胞内，从而标记细胞。Calcein AM本身并无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein)，从而被滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光。与其它同类探针相比，由于Calcein AM的细胞毒性非常低，几乎不会影响细胞功能如细胞增殖或淋巴细胞的趋化性等，而且对pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前活细胞荧光染色的最理想探针之一。
由于死细胞缺乏酯酶，Calcein AM进入细胞后仅活细胞会被染色为绿色荧光，所以可对活细胞进行定量荧光检测。本检测方法无需任何放射性同位素标记(如[3H]-thymidine掺入法)或溶解步骤(如MTT检测)，通常无须洗涤，即可获得高度可重复性和精确性的细胞增殖检测结果。本试剂盒用于活细胞数量荧光检测的结果参考图1。
图1. Calcein AM细胞活性检测试剂盒用于检测MOLM13 (人急性髓原白血病细胞)活细胞数量的效果图。MOLM13细胞经计数后按3倍稀释接种到HuayunGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)中，加入Calcein AM检测工作液孵育30分钟，随后直接在荧光酶标仪下检测Ex/Em=494/517nm。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
核酸红色荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活细胞的细胞膜而只能染色细胞膜完整性被破坏的死细胞，所以Calcein AM常常与碘化丙啶(ST511)联合使用，对活细胞和死细胞同时进行双重荧光染色。本试剂盒中的Calcein AM (1000X)与碘化丙啶(需另购，ST511/ST512/ST1569)用于活细胞和死细胞双染的结果参考图2。
图2. Calcein AM细胞活性检测试剂盒与碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)联合使用检测L-929活细胞与死细胞的效果图。L-929细胞在明场视野下可见明显的坏死细胞(图A)；绿色荧光标记的即为Calcein染色的活细胞(图B)，红色荧光标记的即为PI染色的死细胞(图C)；Calcein和PI双染merge后更可以观察到活细胞和死细胞的差别(图D)。在本实验中，L-929细胞经TSZ处理3小时。TSZ为TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK组成的细胞程序性坏死诱导试剂盒(C1058)。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
本试剂盒可以应用于大多数的哺乳动物细胞。有报道称Calcein AM也可以用于某些植物细胞如拟南芥(Arabidopsis)的根边缘样细胞(root border-like cells)及某些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae。某些寄生虫如Leishmania由于细胞膜组分的原因，Calcein AM不能进入活细胞，但却可以进入凋亡早期的寄生虫细胞，从而与PI联用用于检测凋亡早期的寄生虫。由于真菌和细菌有细胞壁，会阻碍Calcein进入细胞，因此Calcein AM不适合用于真菌和细菌。
Calcein本身是一种金属络合指示剂，在生理pH条件下和Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Mn²⁺等金属离子络合时，荧光信号会发生淬灭。使用本试剂盒的时候需要避免在细胞培养液中额外添加这些影响Calcein荧光的物质。Calcein AM及其水解产物Calcein的分子结构式参考图3。
图3. Calcein AM及其水解产物Calcein的分子结构式。
Calcein AM的水解产物Calcein的最大激发光波长为494nm，最大发射波长为517nm。Calcein的激发光谱和发射光谱参考图4。
图4. Calcein的激发光谱和发射光谱。
本试剂盒提供的Calcein AM为1000X溶液。该1000X的Calcein AM溶液经过优化，对大多数细胞都适用，但为得到比较理想的结果，也可根据细胞类型和实验实际情况对Calcein AM在500-2000稀释倍数之间进行适当调整。本试剂盒同时提供适合Calcein AM染色的检测缓冲液，该染色液可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好。
华韵各种细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择，请参考https://www.huayunbio.cn/support/cell-proliferation.htm。
对于96孔板，按1:1000配制Calcein AM检测工作液，且每孔使用100μl Calcein AM检测工作液，此时本试剂盒C2013S可进行100次检测，C2013M可进行500次检测，C2013L可进行2500次检测。