组织总RNA提取方法

细胞样本收集及处理：

取适量(约50mg-100mg)组织（肺脏，肝脏，肿瘤等，为避免误差可取相同位置大小的组织样本），置于RNase-free EP管中，负八十保存。

试剂耗材准备：

电转，灭菌5ml EP管，装有无菌水的50 ml，卫生纸，镊子，三氯甲烷（氯仿），异丙醇，75 %无水乙醇（DEPC水配置），DEPC水，1.5 ml RNase-free EP管，RNase-free枪头，冰盒。

提取步骤：

1. 负八十冰箱取出样品，取适量组织（可统一称取相同质量的样本）样品置于5ml EP管中，加入500 μl Trizol浸没组织，用电转（3挡位）研磨组织（20~30s）直至粉碎（每个样品间隔用水清洗一遍转头，减少交叉污染），转移至1.5 ml RNase-free EP管中,再补加500 μl Trizol。放置于冰上裂解5min。（提前预冷离心机至4度）

2.加入200 μl 氯仿（三氯甲烷）（加入氯仿体积为Trizol体积的1/5），剧烈震荡（乳白红色），冰上静置10 min。

3.放置于预冷的离心机，离心（4度，12000 rpm，15 min），可见明显分三层（上层无色透明水相为RNA层，中间很薄的乳白色为DNA层，下层为红色为蛋白层，底部可见大组织块沉淀）。

4.小心缓慢吸取上清，约400 μl（宁可少吸，也不要多吸取），置于另一个新的1.5 ml RNase-free EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，常温静置放置15 min。

5.离心（4度，12000 rpm，15 min），可见白色沉淀（一般组织沉淀较大）。

6.弃上清，每管加入950 μl 75 %乙醇，上下颠倒混匀（切记不要用枪吹打混匀，这样会造成RNA溶解）。

7.离心（4度，12000 rpm，10 min），可见明显白色沉淀（组织沉淀一般比较大）。

8.离心后，弃掉上清，放入离心机再次瞬离，用10 ul 的移液器洗去残留液体， 开盖晾干（约5 min）。

9.每管根据沉淀大小加入适量DEPC水（一般30~50ul），吹打溶解RNA，十一楼酶标仪测浓度，OD值（260/280=1.8-2.0）标记，负八十保存。

备注：操作过程中佩戴口罩。

各试剂的作用：

1、Trizol

主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

Trizol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。

0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

2、氯仿

为有机溶剂与水互不相溶，RNA（核糖核“酸”的盐型）是离子化合物，溶于水相。

3、异丙醇

能与与任意比例的水混合，因此加入异丙醇，能够夺取RNA/DNA周围的水分，RNA/DNA能够聚集而发生沉淀。

4、乙醇

起到洗涤的作用，一方面可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质，另一方面可以洗掉异丙醇、氯仿试剂，还可以溶解一部分蛋白质。