1、确认软件设置是否正确

对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。

2、确定耗材及仪器配件是否使用正确

耗材对于荧光定量PCR来说比较重要，很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材相关问题包括：

1）错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材

普通PCR耗材一般透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如打折的扩增曲线。

2）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材

荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种，如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好，或者溶解曲线多峰（非特异扩增），甚至是假阴性结果；

3）使用了质量比较差的耗材

目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多，质量也是良莠不齐，在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的，否则会引起一系列问题，造成不必要的浪费。

比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定，这会造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值，更换质量好的耗材后，荧光信号正常；

如果使用的PCR反应板封膜质量不好，在PCR过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形，这样会引起“optical warping”，即“光学扭曲”现象，该实验中由于使用了ROX作为参比染料，ROX有效的校正了这种荧光信号的变化，均一化的扩增图结果是正常的。

除了耗材外，跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确，比如配套的8联管托架，在使用的时候只用托架的下半部分，如果忘记把上半部分取下，有可能会影响扩增。

3、确定所用试剂是否正常

如果设置都正确，耗材及配件也都没问题，但是扩增曲线还是异常，这时候要确定下所用试剂是否正常。

首先要确定试剂是否有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融多次，运输条件是否正常。

可以通过比较试剂的批次号，结合实验中的阳性对照结果，确定试剂的有效性。其次要观察扩增完的试剂体积，如果在扩增过程中有试剂的蒸发，可能会引起扩增曲线抬升现象，如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光，ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增，还是蒸发。

比如反应体系存在蒸发，水分丢失，ROX浓度会增加，ROX参比荧光上抬，而正常孔中ROX荧光会一直不变，所以在加完试剂上机前，一定要检查耗材是否已经密封，防止试剂蒸发，试剂蒸发严重的还可能导致整个实验室的气溶胶污染。

4、确定实验过程中的操作细节

如果以上都正常，还要确定下实验过程中的操作细节。

比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品，如果不是梯度稀释标准品，可能会引起标准曲线扩增效率或者R2值异常；

从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；

定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR体系的20%），更容易发生optical mixing现象。

因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的PCR过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了。