一、游离药物浓度检测的核心挑战

1.蛋白质结合的干扰
生物样本中药物与血浆蛋白（如白蛋白、α1-酸性糖蛋白）的结合率通常较高（>90%），直接检测总药物浓度会高估实际药效浓度。

2.样本复杂性
生物样本中存在内源性干扰物（如脂质、代谢物），需通过前处理技术去除或富集目标分析物。

3.灵敏度与特异性要求
游离药物浓度通常较低（ng/mL至pg/mL级），需高灵敏度的分析方法（如LC-MS/MS）配合高效的前处理技术。

 

二、生物样本分析前处理技术

1. 超滤法（Ultrafiltration）

原理：利用超滤膜（截留分子量通常为10-30 kDa）分离游离药物与蛋白结合药物。

操作步骤：

将生物样本加入超滤管，离心分离游离药物。

收集滤液，直接分析或进一步处理。

优点：

操作简便，无需化学试剂。

适用于大多数药物，尤其是小分子药物。

缺点：

超滤过程中药物可能因非特异性吸附或膜孔堵塞导致回收率降低。

需验证膜对药物的吸附性。

2. 平衡透析法（Equilibrium Dialysis）

原理：将生物样本置于半透膜一侧，缓冲液置于另一侧，药物在两侧达到扩散平衡后，测定缓冲液中的游离药物浓度。

操作步骤：

将样本与透析液（如磷酸盐缓冲液）分别加入透析装置的两侧。

孵育一定时间（通常4-24小时），使游离药物达到平衡。

收集透析液，分析游离药物浓度。

优点：

接近生理条件，结果准确。

适用于大多数药物，尤其是高蛋白结合率药物。

缺点：

耗时较长，操作复杂。

需防止透析膜对药物的吸附。

3. 超速离心法（Ultracentrifugation）

原理：通过高离心力（>100,000 g）使蛋白沉淀，分离游离药物。

操作步骤：

将生物样本高速离心，使蛋白形成沉淀。

收集上清液，分析游离药物浓度。

优点：

适用于大分子药物（如抗体药物）。

无膜吸附问题。

缺点：

设备要求高，操作复杂。

离心过程中可能影响药物稳定性。

4. 固相萃取法（Solid-Phase Extraction, SPE）

原理：利用固相萃取柱选择性富集游离药物，去除蛋白等干扰物。

操作步骤：

生物样本酸化或碱化，破坏药物-蛋白结合。

通过SPE柱富集游离药物，洗脱后分析。

优点：

富集效率高，适用于低浓度药物。

可同时去除脂质等干扰物。

缺点：

需优化酸碱条件，避免药物降解。

操作步骤较多，可能引入误差。

5. 液液萃取法（Liquid-Liquid Extraction, LLE）

原理：利用有机溶剂（如乙酸乙酯、氯仿）萃取游离药物。

操作步骤：

生物样本酸化或碱化，破坏药物-蛋白结合。

加入有机溶剂，萃取游离药物。

蒸发有机溶剂，复溶后分析。

优点：

操作简便，成本低。

适用于大多数药物。

缺点：

有机溶剂可能对药物稳定性有影响。

萃取效率受药物极性影响较大。

 

三、前处理技术的选择与优化

1.药物性质：

小分子药物：优先选择超滤法或平衡透析法。

大分子药物（如抗体药物）：优先选择超速离心法。

2.样本类型：

血浆：超滤法或平衡透析法。

组织液：需结合SPE或LLE进行富集。

3.分析方法：

LC-MS/MS：需高纯度样本，优先选择SPE或LLE。

免疫分析法：对样本纯度要求较低，可选择超滤法。

 

四、前沿技术进展

1.微流控技术：
结合超滤或平衡透析，实现高通量、自动化游离药物浓度检测。

2.纳米材料富集：
利用纳米颗粒（如磁性纳米粒子）选择性富集游离药物，提高灵敏度。

3.在线前处理技术：
将前处理步骤与分析仪器（如LC-MS/MS）联用，减少人为误差。

 

五、总结

游离药物浓度检测的前处理技术需根据药物性质、样本类型和分析方法进行优化。超滤法和平衡透析法因其操作简便、结果准确，是目前最常用的方法。随着技术的发展，微流控、纳米材料等新技术有望进一步提高游离药物浓度检测的效率和灵敏度，为药物研发和临床治疗提供更可靠的数据支持。