一、基因克隆
在构建蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上，通过随机克隆测序，研究人员成功克隆到蜡梅几丁质酶的cDNA基因。例如，有研究克隆到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因，命名为Cpchia（GenBank登录号：FJ749130）。该基因全长1148bp（也有研究显示全长为1184bp），其中含有954bp的开放阅读框，编码一个由317个氨基酸残基组成的几丁质酶。
二、基因结构分析
运用生物信息学手段对Cpchia编码蛋白的结构特点与性质进行分析，发现其包含一个富含cys和gly的几丁质结合域和一个完整保守的几丁质酶催化区，以及一个富含pro的链接区，无C端扩展区，初步推测为Class Ib型几丁质酶，其N端含有一个长约20aa的信号肽序列。该蛋白二级结构主要由α螺旋（65.29%）、少量的延伸链（5.36%）和随机结构（29.33%）组成。同时，该编码蛋白含有多个磷酸化位点，推测翻译后蛋白可能进行多样化修饰，这与几丁质酶多抗性特性相关。
三、原核表达
1.载体构建：将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a（+）中。
2.表达条件：在大肠杆菌BL21细胞中进行表达。有研究采用加入终浓度0.5 mM IPTG，20℃诱导16 h的条件。
3.表达形式：以包涵体形式表达融合蛋白。
4.表达量：有研究显示，诱导后目的蛋白表达量占菌体总蛋白35%以上。
四、表达产物特性分析
1.纯化复性：分离纯化采用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。利用含有8M尿素的包涵体溶解缓冲液将包涵体变性溶解，4℃高速离心后将上清透析复性，得到浓度和纯度很高的重组蛋白。
2.酶活性检测：几丁质酶活性检测证实复性后的目的蛋白具有一定的活性。例如，经DNS法检测，酶活性达到200U·mL⁻¹。
3.酶活性与稳定性：温度梯度实验显示该几丁质酶在40℃活性最高，50℃以下保持活性稳定，80℃接近失活。pH梯度实验显示该几丁质酶在pH7.0环境条件下活性和稳定性最高。
