一、STR鉴定基础原理与流程
1.什么是STR？
定义：STR是基因组中2-6个碱基组成的短核苷酸重复序列（如(TATC)n），因重复次数（n）不同而具有多态性。
作用：不同个体/细胞系的STR等位基因组合具有唯一性，类似DNA“条形码”，可用于身份识别。
2.STR鉴定流程
样本准备：提取细胞DNA（建议浓度≥20 ng/μL，总量≥50 ng）。
PCR扩增：使用多色荧光标记引物扩增16-24个STR位点（如ATCC标准位点）。
毛细管电泳检测：通过片段分析仪分离PCR产物，获取等位基因长度数据。
数据分析：比对STR图谱与数据库（如ATCC、DSMZ），计算匹配度（相似性系数）。
二、STR鉴定常见问题与解决方案
1. 样本问题
Q1：细胞系污染或交叉污染如何识别？
现象：STR图谱中出现与已知细胞系不匹配的等位基因峰（如混合峰型）。
案例：HeLa细胞污染其他细胞系时，STR图谱会同时出现HeLa特征峰（如D5S818位点为11,12）和宿主细胞峰。
解决方案：立即停止实验，排查培养条件（如CO₂浓度、培养基类型）、操作规范（如无菌操作、分装保存），并重新复苏早期冻存细胞。
Q2：细胞传代次数过多导致STR图谱漂变？
机制：长期传代可能引发染色体不稳定或遗传突变，导致STR位点重复次数改变。
验证方法：对比早期传代与当前传代细胞的STR图谱，若匹配度<80%，则提示遗传漂变。
建议：定期（每10-20代）进行STR鉴定，优先使用低传代细胞（P10以内）。
2. 实验技术问题
Q3：DNA质量差导致STR图谱异常？
表现：峰型拖尾、杂峰多、等位基因缺失。
原因：DNA降解（如反复冻融）、浓度不足或蛋白污染。
优化：
使用新鲜细胞（建议1×10⁶个细胞/样本），避免使用长期冻存样本。
采用柱式法或磁珠法提取DNA，确保纯度（A260/A280=1.8-2.0）。
若DNA降解，可尝试全基因组扩增（WGA）技术补救。
Q4：PCR扩增失败或峰型异常？
可能原因：引物设计缺陷、PCR体系污染、电泳条件不当。
排查步骤：
更换引物组（如从Promega PowerPlex系统切换至Thermo Fisher AmpFlSTR系统）。
设置阳性对照（如已知STR图谱的细胞系）和阴性对照（无模板DNA）。
调整电泳条件（如毛细管温度、分离电压、进样时间）。
3. 数据分析问题
Q5：如何判断STR图谱匹配度？
标准：
完全匹配：所有位点等位基因完全一致（匹配度100%）。
高度匹配：1个位点内出现1个等位基因差异（可能为自发突变，匹配度>90%）。
不匹配：≥2个位点差异（提示污染或错误标识，匹配度<80%）。
工具推荐：使用STR分析软件（如GeneMapper ID-X、STRmix）自动计算匹配度。
Q6：如何处理混合细胞系STR图谱？
方法：
解卷积分析：通过峰高比例估算混合比例（如主峰高度占比70%，次峰30%）。
分离培养：有限稀释法分离单克隆，重新鉴定STR图谱。
示例：若STR图谱显示15%的HeLa特征峰（D5S818=11,12）和85%的宿主细胞峰，提示污染比例约15%。
三、STR鉴定应用场景与规范
1.应用场景
细胞系认证：新购细胞系首次使用前、发表文章前、申报专利时。
质量控制：细胞库长期保存、共享或分发前。
法规要求：FDA、NIH等机构要求临床前研究必须使用STR验证的细胞系。
2.国际标准与数据库
标准位点：ATCC推荐16个核心位点（如TH01、TPOX、vWA）和2个性别位点（Amelogenin）。
数据库：
ATCC SDO Workgroup：提供STR图谱参考标准。
DSMZ STR Database：收录人类细胞系STR数据。
Cellosaurus：整合全球细胞系STR信息。
四、常见误区与注意事项
误区1：STR鉴定可替代核型分析
纠正：STR鉴定用于身份验证，核型分析（如G显带）用于染色体数目/结构异常检测，二者互补。
误区2：STR位点越多越好
纠正：16-24个位点已足够区分99%的人类细胞系，过多位点可能增加成本但无显著收益。
注意事项
1.避免污染：实验全程使用无菌耗材，操作台紫外线消毒30分钟。
2.保存记录：完整记录STR图谱、匹配度、细胞来源及传代次数。
3.合作机构：优先选择通过CAP/CLIA认证的第三方实验室（如Genewiz、Eurofins）。
五、总结与建议
1.关键点：STR鉴定是细胞系身份验证的“金标准”，需定期开展以避免实验误差和数据偏差。
2.操作建议：
优先使用低传代细胞，避免长期传代。
严格遵循实验操作规范，确保DNA质量。
结合多数据库比对，综合判断STR图谱匹配度。
对污染或漂变细胞系及时弃用或重新建库。
通过规范化的STR鉴定流程，可有效保障细胞系身份的准确性，为科研数据的可靠性和可重复性提供坚实基础。
