一、环境与设施管理：构建物理隔离屏障

1.细胞培养空间分区

核心原则：按污染风险等级划分功能区，避免气溶胶/接触传播。

具体措施：

超净工作台布局：按“高风险→低风险”单向操作（如先处理污染样本，后操作正常细胞）。

独立培养室：敏感细胞（如原代细胞、干细胞）与常规细胞系分室培养，间隔≥3米或独立通风系统。

专用耗材存放：不同细胞系培养基、移液器、离心管等分类存放，避免混用。

案例：某实验室因将HeLa细胞与神经干细胞共处一室，导致后者STR图谱出现HeLa特征峰，实验被迫重做。

2.设备与耗材管理

设备专用化：

高风险操作（如细胞传代、冻存）使用独立设备（如CO₂培养箱、液氮罐）。

普通设备（如离心机、水浴锅）需彻底消毒（75%乙醇擦拭+紫外照射30分钟）后切换细胞系。

耗材灭菌：培养瓶、移液枪头等一次性耗材避免重复使用，开封后24小时内用完。

风险数据：共享离心机导致污染的概率是专用设备的5倍（Nature Methods, 2019）。

 

二、标准化操作流程（SOP）：降低人为失误风险

1.细胞操作“黄金法则”

单向操作：按“冻存→复苏→传代→检测”单向流程，避免反向操作。

无接触传递：使用封口膜密封培养瓶，避免瓶口直接接触台面或手套。

分装与标记：

培养基、冻存液等分装为小份（50 mL/管），标注细胞系名称、日期、操作者。

冻存管采用双标签（管身+管帽），液氮罐内分区存放（按细胞类型/项目）。

2.关键操作节点控制

复苏环节：

液氮罐取样时佩戴护目镜，避免液氮飞溅污染其他冻存管。

37℃水浴快速解冻（≤2分钟），剩余冻存液直接丢弃，禁止回存。

传代环节：

胰酶消化后立即终止（含血清培养基），避免过度消化导致细胞碎片污染。

传代比例固定（如1:3），避免因密度差异引发竞争性生长。

检测环节：

每月进行显微镜形态学筛查（如HeLa细胞呈上皮样贴壁生长，与成纤维细胞形态差异显著）。

每3个月开展STR鉴定，低传代细胞（P10以内）优先用于关键实验。

 

三、技术验证与监测：建立预警机制

1.污染检测技术组合

技术类型	检测对象	检测周期	优势
显微镜观察	细胞形态、悬浮颗粒物	每日	快速发现细菌/真菌污染
黑光灯检测	支原体污染（产生卟啉类物质）	每周	灵敏度约80%，成本低
PCR检测	支原体、细菌、真菌DNA	每季度	特异性高，可检测低浓度污染
STR鉴定	细胞系身份	每6个月	唯一性验证，杜绝交叉污染

2.污染处理与应急预案

轻度污染（如少量细菌）：

培养基中添加抗生素（青霉素100 U/mL+链霉素100 μg/mL），培养3代后PCR复检。

同步复苏备用细胞，避免污染细胞继续使用。

重度污染（如真菌、支原体）：

立即丢弃污染细胞，培养箱用70%异丙醇擦拭，56℃加热30分钟灭活支原体。

实验室暂停使用1周，全体人员重新培训SOP。

交叉污染（STR图谱异常）：

追溯污染源（如共用过移液器/培养箱），隔离相关设备。

从早期冻存细胞重新复苏，并通过单克隆分离技术（有限稀释法）建立纯净细胞系。

 

四、人员培训与文化：强化风险意识

1.分级培训体系

新员工：

理论培训（4学时）：污染案例解析、SOP要点。

实操考核：独立完成细胞复苏、传代、冻存，错误率≤5%。

资深人员：

每半年参与污染应急演练，掌握PCR检测、STR鉴定数据分析。

主导实验室污染风险评估，优化分区布局。

2.质量文化渗透

实验室规范：

禁止佩戴首饰、留长指甲，操作时禁止交谈、饮食。

设立“污染曝光台”，公示近期污染事件及整改措施。

激励机制：

连续1年无污染事故的团队，给予实验耗材预算奖励。

污染事故责任人需提交整改报告，并暂停细胞实验权限1个月。

 

五、关键工具与资源推荐

1.污染检测试剂盒

支原体检测：MycoAlert PLUS Kit（Lonza），灵敏度10 CFU/mL，2小时出结果。

STR鉴定服务：ATCC认证实验室（如Genewiz、Eurofins），10个工作日出具报告。

2.设备与耗材

防污染培养箱：ESCO CelCulture CO₂培养箱，带HEPA过滤和90℃高温灭菌功能。

单通道移液器：Eppendorf Research plus，可121℃高压灭菌，降低交叉污染风险。

3.管理软件

细胞库管理系统：Labguru，支持细胞系STR图谱、传代记录、污染事件追溯。

操作提醒：通过实验室LIMS系统设置检测任务提醒（如STR鉴定到期前1个月）。

4.总结与行动清单

环境管理：3日内完成细胞培养室分区改造，标注高风险区域。

操作规范：本周内修订SOP，新增“单向操作流程图”与“污染应急处理表”。

技术验证：下月采购PCR支原体检测试剂盒，对所有细胞系进行普查。

人员培训：下季度组织全员参与“污染防控实操大赛”，优胜者奖励STR鉴定服务。

 

通过系统性防控，可将细胞系污染风险降低至5%以下，保障科研数据的可信度与实验效率。