荧光共定位分析是一种重要的荧光分析方法，其本质在于分析不同荧光标记的蛋白（这两种荧光必须有独立的发射波长）在空间中的重叠，从而判断这两种蛋白是否处于同一区域，即在同一像素上是否“恰巧”出现了两种不同的荧光分子。以下是荧光共定位分析的详细方法：

一、图像获取与处理

1.图像获取：

图像应以顺序扫描方式获取，以消除荧光的交叉干扰和确保共定位的可靠定量。

图像应以Tiff格式保存，以防止信息丢失。

考虑多种因素，包括免疫荧光的强度和共聚焦用于获取图像的模式。为了获得定量结果具有可比性，同一研究中的所有图片应保持一致。

2.图像预处理：

对于RGB图片，可通过图像拆分功能将各通道分开。如果涉及红绿蓝以外的通道，推荐将各通道分开保存。

ScatterJ等插件要求被导入的图像必须为相同尺寸的8位灰度格式图片，且各图间的像素点应是严格对应的。如有必要，图像导入前可进行去背景处理。

二、共定位分析方法

1.使用ImageJ的Plot Profile工具：

打开需要分析的荧光图片。

将各荧光通道分开。

将多幅图像变成图像栈。

选定图像栈中感兴趣的区域，使用Plot Profile工具进行分析。弹出的图像中，横轴代表线上各像素点，纵轴为各点对应的灰度值，图像代表了灰度的变化趋势。

对比各通道结果图可以大致了解共定位情况。

但此方法不能对共定位进行定量描述，因此需要进行进一步的定量分析。

2.使用Colocalization Finder插件：

打开待分析图片并拆分荧光通道。

使用Colocalization Finder插件分析红绿通道共定位情况。

得到共定位散点图，散点图越接近对角线共定位程度越高。散点图颜色的深浅代表其出现的频率。

除散点图外，Colocalization Finder还可以得到定量数据，如Pearson’s相关系数（PCC）、Manders重叠系数（MOC）等。

3.ScatterJ共定位分析：

ScatterJ是一款基于Java的免费、专业多图像处理ImageJ插件，可用于二维（2D）和三维（3D）图片分析。

ScatterJ可以方便地实现散点图的绘制。散点图的横轴和纵轴分别代表每个像素点在各通道得到的灰度值，图像越接近对角线，表示共定位程度越高。

ScatterJ提供了三种不同的回归方法，包括最小二乘、长轴回归法和简化长轴回归法。勾选Pearson’s coefficient可在结果中显示Pearson相关系数。

三、共定位参数解读

1.皮尔森相关系数（PCC）：

取值范围在-1到1之间。1表示完美相关，-1表示完全负相关，0表示随机关系（蛋白A和蛋白B随机分布，无相关性）。

优点：测量不需要对图片进行预处理，简单且不受用户偏差的影响，分析速度快。

缺点：只适合两种荧光强度呈单一线性关系的情况进行共定位分析，对于没有固定比例分配的两种蛋白的共定位，PCC得到的结果较差。且只能得出一个抽象的整体值，不能反映共定位比例，不适于表征3D图像的共定位。

2.曼德斯共定位系数（MCC）：

MCC最明显的优势在于它比PCC更直观地衡量共定位，能够显示荧光之间的重叠比例。对于PCC不能很好测量的非线性比例的情况，MCC也能很好表征。MCC分析也更适合于3D共定位分析。

缺点：需要进行背景校正，检测前需要利用Threshold或者框选ROI以去除过多背景。

综上所述，荧光共定位分析是一种重要的生物学研究方法，其关键在于选择合适的分析方法和参数，并正确解读分析结果。通过合理的图像获取、预处理和分析步骤，可以获得准确的共定位信息，为生物学研究提供有力支持。