一、自然纯化法

1.原理：利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中，通过自然淘汰法不断排挤其他生长慢的细胞，最终留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。

2.优缺点：

优点：方法简单，无需特殊设备或试剂。

缺点：无法按照实验需求自由选择细胞类型；培养周期长；留下的往往是成纤维细胞，因为成纤维细胞通常具有较强的增殖能力。

3.适用场景：适用于肿瘤细胞或突变的细胞系的建立，这些细胞往往具有较强的增殖优势。

 

二、人工纯化法

人工纯化法是利用人为手段营造对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。常用的方法包括酶消化法、机械刮分法、反复贴壁法和电烙筛选法等。

1. 酶消化法

原理：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶等消化酶的耐受性不同，通过酶消化使两者分开，达到纯化的目的。

操作步骤：

将0.25%胰蛋白酶分两次注入培养瓶中，每次加入适量（如1ml），轻摇使胰蛋白酶流过所有细胞表面，然后倒掉。

将培养瓶放在倒置显微镜下观察，当发现成纤维细胞变圆、部分脱落时，立即加入有血清的培养基终止消化。

用弯头吸管轻轻吹打成纤维细胞生长区域，注意不要吹打上皮细胞生长区域。

吹打结束后，用少量培养基漂洗一遍，然后加入适量培养基继续培养。

隔几日或下次传代时，重复上述操作，经过几次处理，即可将成纤维细胞去除或将两者分开。

注意事项：

消化过程中要严格控制消化时间和消化酶的浓度，避免消化过度。

操作过程中要严格无菌操作，防止污染。

2. 机械刮分法

原理：利用不同类型的细胞在培养瓶上混杂生长的特点，使用细胞刮刀刮除非目的细胞区域，达到纯化目的。

操作步骤：

将培养瓶置于倒置显微镜下，找出不同细胞类型的生长区域。

用硅胶细胞刮在不需要生长的细胞区域推划，使细胞悬浮在培养基中，注意不要伤及所需细胞。

推划后用培养基冲洗振摇两次，倒掉悬浮的细胞，然后加入新鲜培养基继续培养。

数日后如发现不需要的细胞又长出，可再进行上述操作，反复多次即可达到纯化效果。

注意事项：

操作时要轻柔，避免对所需细胞造成损伤。

要在无菌条件下进行操作，防止污染。

3. 反复贴壁法

原理：利用成纤维细胞和上皮细胞的贴壁速度差异进行分离。成纤维细胞贴壁速度快，而上皮细胞贴壁速度慢。

操作步骤：

将细胞悬液接种在不含血清的培养基中（此时上皮细胞贴壁更慢），静置20分钟。

在倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁后，将细胞悬液导入另一个培养瓶中。

继续静置培养20分钟，然后重复上述操作。

经过几次操作后，成纤维细胞和上皮细胞将被分隔开，第一瓶和第二瓶以成纤维细胞为主，往后几瓶以上皮细胞为主。

注意事项：

要在无菌条件下进行操作。

要严格控制静置时间，避免细胞过度贴壁或脱落。

4. 电烙筛选法

原理：在贴壁细胞转化时，转化灶区域的细胞与周边未转化细胞有明显的区域界限。此时可用机械刮除法取出未转化细胞，或用电烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。

操作步骤：

倒去原液，并用记号笔划出转化灶的区域。

用加热的微型电烙器将转化灶周边的细胞全部烫死，只保留转化灶细胞。

在适应性培养基中继续培养，即可达到纯化的目的。

注意事项：

此方法适用于单细胞克隆筛选或转化灶细胞的纯化。

操作时要小心谨慎，避免对转化灶细胞造成损伤。

 

三、总结

原代上皮细胞与原代成纤维细胞的分离纯化是细胞生物学研究中的重要步骤。根据实验需求和细胞特性，可以选择合适的纯化方法。自然纯化法简单但无法自由选择细胞类型，且培养周期长；人工纯化法则更加灵活高效，但操作相对复杂。在实际操作中，可以综合使用多种方法以提高纯化效果。