一、实验准备

1.实验试剂：

培养基：通常使用含有胎牛血清（FBS）和抗生素的培养基，如PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement。

冻存液：用于细胞冻存，如PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO。

洗涤液：用于洗涤细胞和组织，如1× PBS (pH 7.4) + 1% P/S。

消化液：用于消化组织，释放细胞，如PriCells Isolation of Primary Cell Kit。

染色液：用于细胞计数和活性鉴定，如0.4% Trypan Blue。

检测试剂：用于细胞鉴定，如肌动蛋白、α-SMA或Desmin抗体，荧光标记二抗，4%多聚甲醛。

2.实验器械：

培养皿、培养瓶：用于细胞培养。

直剪、眼科剪：用于剪切组织。

眼科镊、止血钳：用于处理组织。

玻璃滴管、烧杯：用于移液和配制溶液。

15ml离心管：用于离心。

 

二、细胞分离

1.取材：

选择健康的成年大鼠，腹腔注射麻醉剂（如5%苯巴比妥）进行麻醉。

无菌条件下迅速取出大鼠主动脉，放入预冷的PBS中。

2.组织预处理：

将主动脉用PBS洗涤多次，去除血管外部的血渍和结缔组织。

用无菌镊子剥去外膜面的残留组织。

3.去除内皮细胞：

将主动脉纵向剪开，内膜面向上。

用无菌镊子沿中轴方向反复刮动内膜层4-5遍，去掉内皮细胞。

用PBS洗涤多次，确保内皮细胞被完全去除。

4.分离中膜：

将去掉内皮细胞的主动脉继续刮动，分离中膜层。

用眼科剪将中膜层剪碎成约1×1mm³的小块。

将剪碎的中膜块用PBS洗涤多次，去除残留的血渍和组织碎片。

5.酶消化：

在中膜块中加入适量的消化酶液（如胰蛋白酶或胶原酶）。

将离心管放入37℃水浴中消化15-20分钟，期间轻轻摇动离心管，以促进酶消化。

消化结束后，加入消化终止液终止酶反应。

6.细胞收集与计数：

将消化液离心（1000rpm，10分钟），弃去上清液。

用培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数和活性鉴定。

 

三、细胞培养

1.培养瓶预包被：

在实验前一天，用培养基或特定的培养基质预包被培养瓶，置于超净台中吹干或45℃烘箱烘干，然后放入4℃冰箱备用。

2.细胞接种：

调整细胞密度至适宜的浓度（如5×10^5个/ml）。

将细胞悬液接种到预包被的培养瓶中，放入37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

3.细胞换液与传代：

根据细胞生长情况，定期更换新鲜的培养基。

当细胞生长至80%-90%汇合度时，进行传代培养。传代时，用胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞沉淀，用培养基重悬后按1:2或1:3的比例接种到新的培养瓶中。

 

四、细胞鉴定

1.显微鉴定：

在相差显微镜下观察细胞形态。主动脉平滑肌细胞通常呈长梭状，具备良好的透光性，细胞之间呈现典型的波峰波谷样生长，有接触抑制的特点。

2.免疫组织化学鉴定：

利用平滑肌细胞特异性抗体（如肌动蛋白、α-SMA或Desmin抗体）进行免疫荧光染色。

在荧光显微镜下观察，平滑肌细胞胞质应呈现较强棕红色荧光。

 

五、注意事项

1.无菌操作：在整个实验过程中，应严格遵守无菌操作规范，以防止细胞污染。

2.细胞活性：在细胞分离和培养过程中，应尽量减少对细胞的机械损伤和化学刺激，以保持细胞的活性。

3.消化条件：酶消化过程中，应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间，避免消化过度或不足。

4.培养条件：确保细胞培养箱内的温度、湿度和CO₂浓度符合细胞生长的需求。