一、实验准备
1.取材：
在无菌条件下，获取目标组织或器官。对于小鼠等实验动物，通常使用颈椎脱臼法处死，然后迅速取出所需组织。
将取出的组织放入预冷的生理盐水或缓冲液（如PBS）中，以保持细胞的活性。
2.器械与试剂准备：
准备无菌的手术器械，如剪刀、镊子、注射器等。
准备所需的消化酶（如胰蛋白酶、胶原酶等）、缓冲液（如PBS、Hanks液等）和培养基。
二、细胞分离
1.组织处理：
将组织块用剪刀剪碎成约0.5-1毫米的小块，以增加消化酶的接触面积。
用缓冲液多次冲洗组织块，以去除血液残留和结缔组织。
2.酶消化：
将剪碎的组织块放入含有适量消化酶的锥形瓶中，置于37℃恒温摇床上进行消化。
消化时间根据组织类型和消化酶的种类而定，一般需要10-30分钟。消化过程中，可定期取样观察消化情况。
3.细胞悬液制备：
消化结束后，加入适量的缓冲液终止消化。
用吸管反复吹打消化后的组织块，使其形成均匀的细胞悬液。
将细胞悬液通过滤网（如100微米或20微米不锈钢筛）过滤，以去除未消化的组织块和大细胞团。
4.细胞洗涤与计数：
将过滤后的细胞悬液进行低速离心（如500转/分钟，5分钟），弃去上清液。
用缓冲液重悬细胞，再次离心洗涤，以去除残留的消化酶和细胞碎片。
用计数板对细胞进行计数，确定细胞悬液的浓度。
三、细胞培养
1.接种细胞：
根据实验需要，将适量的细胞悬液接种到培养皿或培养瓶中。
培养皿或培养瓶应预先涂有适宜的培养基质（如胶原、明胶等），以促进细胞贴壁生长。
2.培养条件：
将接种后的细胞放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养。
根据细胞类型和实验需求，选择合适的培养基进行培养。培养基中通常含有细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。
3.细胞换液与传代：
在培养过程中，定期观察细胞的生长状态，及时更换新鲜的培养基。
当细胞生长至一定密度时，进行传代培养，以保持细胞的活性并扩大培养规模。
四、实验注意事项
1.无菌操作：在整个实验过程中，应严格遵守无菌操作规范，以防止细胞污染。
2.细胞活性：在细胞分离和培养过程中，应尽量减少对细胞的机械损伤和化学刺激，以保持细胞的活性。
3.实验条件：确保实验条件（如温度、湿度、CO₂浓度等）符合细胞生长的需求。
