实验原理
活细胞的密度较小，而死细胞的密度较大。通过密度梯度离心，可以将活细胞和死细胞有效分离。在离心过程中，活细胞会漂浮在高密度溶液（如Ficoll-Paque或Lympholyte-M）的上方，而死细胞则会沉入离心管底部。
实验步骤
1.细胞悬液制备
使用RPMI-5或其他合适的完全培养基混悬细胞。
将细胞悬液分装到离心管中，细胞数控制在每2毫升（12毫升离心管）0.5×108个细胞，或每5毫升（50毫升离心管）1×108个细胞。
2.加入高密度溶液
使用移液器吸取适量的高密度溶液（3毫升用于12毫升离心管，5毫升用于50毫升离心管）。
将移液器枪头伸到离心管底部，缓慢将高密度溶液加入细胞悬液下方，避免产生气泡和混合。
3.密度梯度离心
在室温下，以800g的离心力离心15分钟。
为了取得更好的分离效果，建议关闭离心机的“brake”开关，使离心过程缓慢停止。
4.收集活细胞
使用5毫升移液器，沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头。
小心吸入漂浮在高密度层上方的活细胞，尽量避免收集到高密度溶液。
将活细胞移入另一干净的离心管中。
5.洗涤活细胞
向含有活细胞的离心管中加入适量的RPMI-5完全培养基（少量细胞加入10毫升，细胞量较多时加入40毫升）。
在室温下，以200g的离心力离心10分钟。
弃去上清液，重复洗涤一次。
6.混悬细胞
以适量的培养基重新混悬细胞，以便进行下一步操作。
注意事项
1.温度控制
高密度溶液（如Ficoll-Paque和Lympholyte-M）的密度与温度有关，适合在室温下使用。
在实验过程中，应确保细胞悬液、离心和高密度溶液的温度控制在室温，避免因温度差异导致活细胞损失。
2.离心条件
离心机的“brake”开关应关闭，使离心过程缓慢停止，有助于获得更好的分离效果。
离心力和离心时间应根据实验条件和离心机的性能进行适当调整。
3.操作技巧
在加入高密度溶液时，应缓慢操作，避免产生气泡和混合。
在收集活细胞时，应沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头，避免吸入高密度溶液。
4.细胞活性
在实验过程中，应尽量减少对细胞的机械损伤和化学刺激，以保持细胞的活性。
通过一步梯度法去除死细胞，可以有效地提高小鼠单个核细胞的纯度和活性，为后续的实验研究提供高质量的细胞样本。
