一、材料准备
1.实验动物：
选用未孕的清洁级SD雌性大鼠，年龄一般为2125天或1012周龄，体重约200克。
2.试剂与培养基：
孕马血清促性腺激素（PMSG）：用于诱导大鼠卵巢发育。
磷酸盐缓冲液（PBS）：用于清洗卵巢。
双抗（青霉素和链霉素）：用于防止细菌污染。
DMEM/F12培养基：用于细胞培养。
胎牛血清（FBS）：为细胞提供营养支持。
胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）：用于消化卵巢组织，释放颗粒细胞。
卵泡刺激素受体（FSHR）抗体：用于细胞鉴定。
3.实验器材：
解剖显微镜、离心机、培养箱、移液器、细胞培养板等。
二、原代培养步骤
1.动物处理：
对大鼠进行皮下注射PMSG，剂量一般为40~60IU/只。
注射后48小时，通过颈椎脱臼法处死大鼠。
2.卵巢取材：
将大鼠浸入75%乙醇中浸泡消毒5~10分钟。
在无菌条件下迅速剖取卵巢，放入预冷的PBS中。
去除卵巢周围的组织及表面包膜，用含双抗的PBS多次洗涤。
3.颗粒细胞分离：
在解剖显微镜下，用注射器针头刺破卵泡，释放颗粒细胞。
将悬液通过70~200目的细胞筛网过滤，去除组织碎片。
离心收集细胞，弃去上清液。
4.细胞消化：
向细胞沉淀中加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合液，重悬细胞。
在37℃、5%CO₂的培养箱中消化30~60分钟，期间可适当吹打悬液，促进细胞分散。
加入含有胎牛血清的培养液终止消化。
5.细胞接种：
将消化后的细胞悬液再次离心，弃去上清液。
用DMEM/F12完全培养基（含10%~15%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素）重悬细胞。
台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞密度至适宜浓度。
将细胞接种于培养瓶中或培养板中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。
6.换液与培养：
接种后24小时进行首次换液，去除未贴壁的细胞。
此后每隔一天或半量换液一次，根据细胞生长状态调整换液频率。
三、细胞鉴定
1.形态学观察：
在倒置显微镜下观察细胞形态。颗粒细胞呈圆形、椭圆形或多边形，贴壁生长后逐渐铺展成单层。
2.免疫组织化学染色：
选用FSHR抗体进行免疫组织化学染色。颗粒细胞是卵巢内唯一表达FSHR的细胞，因此FSHR阳性染色可作为鉴定颗粒细胞的依据。
四、注意事项
1.无菌操作：整个实验过程应严格遵循无菌操作规范，防止细菌污染。
2.细胞消化时间：胰蛋白酶消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
3.培养基选择：选择合适的培养基和血清浓度，以支持细胞的生长和增殖。
4.细胞密度：接种时细胞密度不宜过高或过低，以保证细胞的良好生长状态。
通过上述步骤，可以成功获得高纯度、高活性的大鼠卵巢颗粒细胞，为后续的实验研究提供可靠的细胞模型。
