一、基本原理
单个核细胞（如淋巴细胞和单核细胞）的密度略低于红细胞和粒细胞。利用这一特性，可以选择一种具有适当密度的溶液（如Ficoll溶液）作为分离介质，通过密度梯度离心的方法，将单个核细胞从其他细胞成分中分离出来。
二、常用试剂与材料
1.密度梯度分离液：常用的有Ficoll-Hypaque（商品名为Ficoll-Paque），比重约为1.077±0.001，用于形成密度梯度。
2.缓冲液：如磷酸盐缓冲液（PBS）或Hank's平衡盐溶液（HBSS），用于稀释血液样本和洗涤细胞。
3.抗凝剂：如肝素或乙二胺四乙酸（EDTA），用于防止血液凝固。
4.离心管：用于离心操作。
5.移液管或巴氏吸管：用于加样和吸取细胞层。
三、实验步骤
1.样本准备：
使用抗凝剂处理后的新鲜血液样本。
将血液样本与等量的缓冲液（如PBS）混合，以稀释血液，便于后续操作。
2.加入分离液：
将适量的密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）缓慢加入离心管底部。
3.叠加样本：
使用移液管或巴氏吸管，将稀释后的血液样本缓慢叠加在分离液上层，形成清晰的界面。
4.离心分离：
将离心管放入离心机中，以适当的离心速度（如400-500g）和时间（如20-30分钟）进行离心。
离心后，离心管内会形成明显的分层：上层为血浆和血小板层，下层为红细胞和粒细胞层，中间为单个核细胞层（呈白色云雾状）。
5.收集单个核细胞：
使用移液管或巴氏吸管，小心吸取中间层的单个核细胞，避免吸到上层的血浆和下层的红细胞。
将吸取的单个核细胞转移至新的离心管中。
6.洗涤细胞：
使用缓冲液（如PBS）洗涤单个核细胞，以去除残留的分离液和杂质。
离心后，弃去上清液，重复洗涤1-2次。
7.细胞计数与重悬：
对洗涤后的单个核细胞进行计数。
根据实验需要，使用适当的培养基或缓冲液重悬细胞。
四、注意事项
1.无菌操作：整个实验过程应在无菌条件下进行，以防止细胞污染。
2.操作轻柔：在处理细胞样本和分离液时，应轻柔操作，避免剧烈震荡，以免破坏细胞。
3.离心条件：离心速度和时间应根据离心机的型号和样本量进行调整，以获得最佳的分离效果。
4.细胞活力检测：在分离后，可以使用台盼蓝染色等方法检测单个核细胞的活力。
五、应用领域
密度梯度分离法分离出的单个核细胞（MNCs）广泛应用于免疫学、细胞生物学、再生医学等领域的研究。例如，可以用于分离和纯化外周血单个核细胞（PBMCs），进一步研究其在免疫反应、细胞分化、细胞治疗等方面的作用。
通过以上步骤，可以有效地从血液样本中分离出单个核细胞（MNCs），为后续的实验研究提供高质量的细胞来源。
