一、试剂和材料
1.一抗：
ABCG2：小鼠单克隆抗体（如BXP-21），稀释比例为1:100。
连接蛋白-43（CX43）：兔多克隆抗体，稀释比例为1:100。
细胞角蛋白3（K3）：小鼠单克隆抗体（如AE5），稀释比例为1:500。
细胞角蛋白12（K12）：兔多克隆抗体，稀释比例为1:200。
2.二抗：
抗小鼠IgG：Alexa-488标记，稀释比例为1:2500。
抗兔IgG：Alexa-546标记，稀释比例为1:1500。
封闭抗体：PBSA（磷酸盐缓冲盐水）配制的10%热灭活羊血清。
3.其他试剂：
Triton X-100：用于细胞破膜。
PBSA：用于洗涤细胞。
多聚甲醛（PFA）：将16%原液用PBSA现配成4%的工作浓度，用于细胞固定。
4.Immu-Mount防褪色封片剂：用于封片。
载玻片和盖玻片。
5.设备：共聚焦显微镜或荧光显微镜。
二、实验步骤
1.细胞培养：将角膜缘干细胞培养在塑料平皿或羊膜上，直至细胞生长到所需状态。
2.细胞固定：
用CMF-Saline G（或PBS）洗涤细胞一次。
加入新鲜配制的4% PFA，室温固定15分钟。
用PBSA洗涤细胞一次。
3.细胞破膜：加入0.1% Triton X-100，室温孵育10分钟，以破坏细胞膜，使抗体能够进入细胞内。
4.封闭：加入PBSA配制的10%热灭活羊血清，室温孵育30分钟，以封闭非特异性结合位点。
2.一抗孵育：
去除封闭液，加入稀释后的一抗（如ABCG2、CX43、K3、K12等），室温孵育1小时。
用PBSA洗涤细胞两次，每次5分钟。
6.二抗孵育：
加入稀释后的二抗（如抗小鼠IgG-Alexa-488、抗兔IgG-Alexa-546），室温孵育1小时。
用PBSA洗涤细胞两次，每次5分钟。
7.封片：将盖玻片放在载玻片上，用最小体积的Immu-Mount防褪色封片剂封片。
8.观察：在荧光显微镜或共聚焦显微镜下，使用40×油镜对样本进行观察，记录和分析染色结果。
三、注意事项
1.抗体选择：根据实验目的选择合适的抗体，确保抗体的特异性和灵敏度。
2.固定和破膜：固定和破膜的时间应根据细胞类型和实验条件进行调整，以避免细胞损伤或抗体无法进入细胞内。
3.洗涤：在每次抗体孵育后，应充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和杂质。
4.封片：封片时应避免气泡和溢胶，以确保观察效果。
5.观察：使用合适的显微镜和滤光片观察染色结果，记录和分析细胞的形态和分布。
