实验准备
一、实验材料：
1.小鼠：选择健康、适龄的实验小鼠，如C57BL/6小鼠，数量根据实验需求确定。
2.Hank's平衡盐溶液（HBSS）
3.ASC培养基：通常含10%胎牛血清的DMEM，添加1%的青链霉素双抗（P/S）
4.胶原酶溶液：例如，100ml HBSS中加入1g牛血清白蛋白和0.1g II型胶原酶
5.聚乙烯吡咯烷酮碘溶液（PVP-I）
6.培养皿、离心管、组织培养瓶等
7.无菌手术器械：剪刀、镊子、手术刀等
8.麻醉剂：如三溴乙醇或戊巴比妥钠
二、实验设备：
1.层流净化罩或超净工作台
2.37℃恒温水浴箱
3.离心机
4.显微镜
5.细胞培养箱（37℃，5% CO₂）
三、实验步骤
1.小鼠麻醉与处死：
使用麻醉剂（如三溴乙醇或戊巴比妥钠）腹腔注射麻醉小鼠。
麻醉后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。
2.无菌操作：
将小鼠转移至层流净化罩或超净工作台中，用70%酒精消毒腹部皮肤。
3..脂肪垫取材：
沿小鼠腹中线做低位横向切口，打开腹腔。
用镊子小心分离并取出性腺/附睾和腹股沟处的脂肪垫。
4.脂肪组织处理：
将取出的脂肪组织置于含有HBSS的培养皿中，漂洗去除血液和杂质。
用无菌剪刀将脂肪组织剪碎成小块。
5.酶消化：
将剪碎的脂肪组织转移至离心管中，加入与组织体积相同的胶原酶溶液。
将离心管置于37℃恒温水浴箱中消化60分钟，期间不时混匀。
6.离心与分离：
消化结束后，将离心管置于离心机中，以50-100g的离心力离心5分钟。
取出离心管，用力摇晃以分离基质细胞与原代脂肪细胞。
再次离心，去除上层油脂和未消化的脂肪组织。
7.细胞重悬与培养：
用HBSS或PBS洗涤细胞沉淀2-3次，去除残留的胶原酶和杂质。
用ASC培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度后，转移至组织培养瓶中。
将培养瓶置于37℃，5% CO₂的细胞培养箱中培养。
8.换液与传代：
细胞贴壁生长2-4天后，首次换液，去除未贴壁的细胞。
以后每周更换培养基2次，根据细胞生长情况适时传代。
四、注意事项
1.无菌操作：整个实验过程必须在无菌条件下进行，以防止细胞污染。
2.酶消化时间：胶原酶的消化时间应根据脂肪组织的量和质地调整，避免消化过度或不足。
3.细胞密度：接种细胞时，应控制适当的细胞密度，以促进细胞贴壁和生长。
4.培养条件：细胞培养箱应保持恒定的温度和气体浓度，为细胞生长提供适宜的环境。
通过以上步骤，可以从正常小鼠腹股沟脂肪垫中成功获取脂肪源干细胞，用于后续的细胞培养、扩增和实验研究。
