一、微生物菌种冷冻干燥保藏技术

1. 技术原理

冷冻干燥保藏法（简称冻干法）是一种将微生物菌种在低温下快速冻结，然后在真空环境中使水分升华干燥，以达到长期保藏菌种的方法。通过这种方法，微生物的生理活动趋于停止，从而延长其存活时间并保持其活力。

2. 操作步骤

（1）安瓿管准备：选用耐温度骤变、耐压、管壁厚度均一的中性玻璃安瓿管。先用2%的盐酸浸泡过夜，然后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后贴上标签，加入脱脂棉塞，121℃高压灭菌15-20分钟备用。

（2）保护剂选择与配制：根据微生物菌种的类型选择合适的保护剂，如脱脂乳、甘油、二甲亚砜等。保护剂的浓度和pH值需根据菌种特性调整，并进行灭菌处理。

（3）菌悬液制备：在最适宜的培养条件下，将微生物培养至静止期或成熟期。进行纯度检查后，与保护剂混合均匀，制备成菌悬液。菌悬液的浓度应适中，一般细胞或孢子不少于108−1010个/mL。

（4）分装与预冻：在无菌条件下，采用较长的滴管将菌悬液直接滴入安瓿管底部，每管分装量约0.1-0.2mL。然后将安瓿管置于-80℃冰箱中预冻3小时以上，使菌悬液完全冻结。

（5）冷冻干燥：将预冻后的安瓿管迅速置于已充分预冷的冷冻干燥机样品舱内，关闭放气阀，打开真空泵开始冷冻干燥。冷冻干燥时间一般为8-20小时，具体时间根据菌种和设备而定。干燥过程中，需注意观察冻干物的状态和真空度，确保干燥效果。

（6）真空封口：冷冻干燥完毕后，取出安瓿管置于干燥器内。然后，在距管口约5cm处用喷射火焰（如喷灯、焊枪等）将安瓿管拉细，在真空条件下用火焰对准安瓿管细颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪检测真空度。

（7）保藏与检测：封口完全的冷冻干燥管应低温避光保藏。一般在封口后1天、7天、30天随机抽取若干只冷冻干燥管进行存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等检测，以确保菌种质量。

3. 适用范围

冷冻干燥保藏法适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、部分丝状真菌和酵母等的中长期保藏。但不适用于藻类和原虫等微生物。

4. 优点

保藏时间长：可达数年甚至数十年。

菌种活力高：复苏后菌种生长良好，遗传特性稳定。

适用范围广：适用于多种微生物菌种。

5. 缺点

操作复杂：步骤较多，需要专业设备和技术。

成本较高：设备和耗材成本较高。

二、微生物菌种液氮保藏技术

1. 技术原理

液氮保藏法是利用液氮（-196℃）的超低温环境来保藏微生物菌种的方法。在超低温下，微生物的新陈代谢活动完全停止，从而达到长期保藏的目的。

2. 操作步骤

（1）安瓿管或冻存管准备：选用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管或螺旋口的塑料冻存管，确保无裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净，121℃高压灭菌15-20分钟备用。

（2）保护剂准备：根据微生物菌种的类型选择合适的保护剂，如甘油、二甲亚砜等。保护剂的浓度一般为10-20%。

（3）菌悬液制备：在最适宜的培养条件下，将微生物培养至静止期或成熟期。然后，刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；或者接种液体培养基振荡培养后，取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内。菌悬液的浓度应适中。

（4）预冻：将装有菌悬液的冻存管置于程序控温降温装置或分段降温装置中，控制冷冻速度以每分钟下降1℃为宜，使样品冻结到-35℃。

（5）保藏：将预冻后的冻存管置于液氮罐中保藏。液氮罐的气相中温度一般为-150℃，液相中温度为-196℃。

（6）复苏：从液氮罐中取出冻存管后，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动，直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。然后，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

3. 适用范围

液氮保藏法适用于各种微生物菌种的长期保藏，特别是稀有或特殊的菌种。

4. 优点

保藏效果好：菌种存活率高，遗传特性稳定。

操作简便：步骤相对简单，易于操作。

适用范围广：适用于各种微生物菌种。

5. 缺点

设备昂贵：液氮罐和冷冻设备成本较高。

安全隐患：液氮具有低温危险，操作时需注意安全。

三、总结

微生物菌种冷冻干燥保藏法和液氮保藏法各有优缺点，选择哪种方法取决于实验室的具体条件、菌种特性和保藏需求。对于需要长期保藏且对菌种活力要求较高的菌种，可以选择冷冻干燥保藏法；对于需要快速保藏且操作简便的菌种，可以选择液氮保藏法。无论采用哪种方法，都需要严格遵守操作规程，确保菌种保藏的质量和安全。