一、取材与预处理
1.取材：
选择新鲜、健康且处于活跃生长状态的组织。例如，对于皮肤上皮细胞培养，应避免使用有炎症、损伤或病变的皮肤组织。
将组织切成适当大小的小块，一般剪成1~3毫米³的小块为宜，既便于后续操作，又能保证足够的细胞释放。
2.预处理：
在无菌条件下，用预冷的缓冲液（如PBS）迅速清洗组织，去除血液、杂质和可能的污染物。
对于某些类型的上皮细胞（如皮肤上皮细胞），可能需要进行EDTA处理，以去除细胞间的钙离子，便于后续分离。
二、消化与分离
1.消化：
根据上皮细胞的类型，选择合适的消化酶（如胰蛋白酶、胶原酶等）进行消化。消化时间、温度和酶的浓度需根据具体情况进行调整。
例如，对于皮肤上皮细胞，可以先用胰蛋白酶在4℃下冷消化过夜，然后用胰蛋白酶在37℃下温消化30~60分钟。
2.分离：
使用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开（适用于皮肤上皮细胞）。
通过离心、过滤等方法去除消化液和杂质，获得细胞悬液。
三、培养与传代
1.培养：
选择合适的基础培养基，如DMEM/F12、RPMI-1640等，并根据需要添加血清、生长因子等添加物。
将细胞悬液接种到培养瓶或培养皿中，置于适宜的温度（如37℃）和气体环境（如5% CO₂）下培养。
定期更换培养基，观察细胞的生长状态，及时调整培养条件。
2.传代：
当细胞生长至80%~90%汇合度时，进行传代操作。
先吸弃旧培养基，用预热的无钙镁离子的PBS轻轻冲洗细胞，去除残留的培养基和血清。
加入适量的胰蛋白酶-EDTA消化液，覆盖细胞表面，在适宜温度下孵育一段时间（如1~3分钟），待细胞变圆、开始脱落时，立即加入含有血清的培养基终止消化。
轻轻吹打细胞，使其形成均匀的细胞悬液，然后按照合适的比例接种到新的培养器皿中。
四、注意事项
1.无菌操作：在整个培养过程中，应严格遵循无菌操作原则，避免污染。
2.培养基选择：根据上皮细胞的类型和培养目的，选择合适的基础培养基和添加物。
3.培养条件优化：根据细胞的生长状态和培养需求，及时调整培养条件，如温度、气体环境、培养基成分等。
4.细胞纯化：上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞等杂质细胞，需要通过差速贴壁、免疫磁珠分离等方法进行纯化。
五、特殊培养方法
1.饲养层培养：对于某些类型的上皮细胞（如小鼠表皮细胞），可以在以3T3细胞为饲养层的条件下进行培养，以促进细胞的生长和分化。
2.无血清培养：对于某些对血清敏感的上皮细胞，可以尝试采用无血清培养基进行培养，以避免血清中的成分对细胞生长产生不利影响。
