一、原理

细胞凋亡时，基因组DNA会断裂，暴露出3'-OH基团。利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）的催化作用，可以将脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3'-OH末端，与dATP形成异多聚体。然后，这些标记物可以与连接了报告酶（如过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合的底物存在下，过氧化物酶会产生很强的颜色反应，特异准确地定位出正在凋亡的细胞，从而可以在普通光学显微镜下进行观察。

二、试剂与材料

进行过氧化物酶标记测定细胞凋亡实验时，需要准备以下试剂和材料：

1.磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：用于洗涤细胞和组织切片。

2.蛋白酶K：用于去除组织蛋白，暴露DNA的3'-OH末端。

3.含2%过氧化氢的PBS缓冲液：用于灭活内源性过氧化物酶，防止非特异性染色。

4.TdT酶缓冲液：用于配制TdT酶反应液。

5.TdT酶反应液：含有TdT酶和底物dUTP，用于催化dUTP掺入到DNA的3'-OH末端。

6.洗涤与终止反应缓冲液：用于洗涤细胞和组织切片，终止反应。

7.二氨基联苯（DAB）溶液：作为过氧化物酶的底物，用于显色反应。

8.甲基绿：用于复染细胞核，便于观察。

9.过氧化物酶标记的抗地高辛抗体：用于检测掺入到DNA中的地高辛标记物。

此外，还需要准备石蜡包埋的组织切片、冰冻切片或培养的细胞等样品。

三、实验步骤

以石蜡包埋的组织切片为例，实验步骤如下：

1.切片预处理：

将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5分钟。

用无水乙醇洗两次，每次3分钟。

用95%和75%乙醇各洗一次，每次3分钟。

用PBS洗5分钟，加入蛋白酶K溶液（如20μg/ml），于室温水解15分钟，去除组织蛋白。

用蒸馏水洗4次，每次2分钟。

2.TdT酶反应：

在色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5分钟。用PBS洗两次，每次5分钟。

用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1~5分钟。

用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1小时（阴性染色对照加不含TdT酶的反应液）。

3.显色与复染：

将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30分钟，每10分钟将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

用PBS洗3次，每次5分钟。

直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30分钟。

用PBS洗4次，每次5分钟。

在组织切片上直接滴加新鲜配制的DAB溶液，室温显色3~6分钟。

用蒸馏水洗4次，前3次每次1分钟，最后1次5分钟。

用甲基绿进行复染10分钟。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30秒。

4.脱水、封片与观察：

依同样方法再用100%正丁醇洗三次。

用二甲苯脱水3次，每次2分钟。

封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

四、注意事项

1.设立对照：实验过程中应设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松等凋亡诱导剂处理后的细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。

2.操作规范：整个操作过程应遵循无菌原则，避免污染。

3.条件优化：根据具体实验条件和细胞类型，可能需要对实验条件进行优化，如调整蛋白酶K的浓度和孵育时间、TdT酶反应液的组成和反应时间等。

五、应用范围

过氧化物酶标记测定细胞凋亡方法灵敏度高、特异性好，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片和培养的细胞等多种样品。在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。