一、选择合适的siRNA
1.设计原则：
从靶基因转录本的AUG起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列作为潜在的siRNA靶位点。
避免选择GC含量过高或过低的siRNA序列，一般GC含量在45%~55%左右的siRNA效果较好。
避免针对靶基因的5'和3'端非编码区（UTRs）设计siRNA，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，可能影响siRNA的效果。
将潜在的siRNA序列与基因组数据库进行比较，排除与其他基因编码序列有高度同源性的序列，避免脱靶效应。
2.验证有效性：
一个基因通常需要设计多个靶序列的siRNA，通过实验验证其有效性，选择沉默效果最好的siRNA进行后续实验。
可以使用在线工具或商业服务进行siRNA的设计和优化。
二、 高效的转染方法
1.选择合适的转染试剂：
根据细胞类型选择合适的转染试剂，如脂质体转染试剂、电穿孔法、病毒载体等。
转染试剂的选择应考虑到转染效率、细胞毒性、操作简便性等因素。
2.优化转染条件：
调整转染试剂与siRNA的比例、转染时间、细胞密度等条件，以提高转染效率。
在进行大规模实验前，应先进行小规模的转染条件优化实验。
三 、设置合适的对照实验
1.阴性对照：
使用与靶基因序列无同源性的siRNA作为阴性对照，以验证siRNA的特异性。
阴性对照的siRNA序列通常是通过打乱靶基因siRNA序列的碱基排列得到的。
2.阳性对照：
使用已知能有效沉默靶基因的siRNA或针对管家基因的siRNA作为阳性对照，以验证转染和沉默系统的有效性。
阳性对照的结果应显示靶基因表达水平的显著降低。
3.Mock对照：
只加转染试剂不加siRNA的对照，用于评估转染试剂对细胞活力的影响。
四、检测靶基因表达水平的变化
1.mRNA水平检测：
使用RT-PCR或qRT-PCR等方法检测靶基因mRNA水平的变化，以验证siRNA的沉默效果。
2.蛋白水平检测：
使用Western blot等方法检测靶基因蛋白水平的变化，进一步验证siRNA的沉默效果。
有时，即使mRNA水平没有显著变化，蛋白水平也可能受到显著影响，这可能与siRNA的作用机制有关。
五、避免RNA酶污染
1.实验环境：
实验过程中应严格遵循无菌操作原则，避免RNA酶污染。
使用无RNA酶的水、试剂和耗材。
2.操作技巧：
避免频繁开启离心管盖，减少RNA酶与RNA的接触机会。
使用DEPC水处理实验器材和耗材，以灭活RNA酶。
六、细胞状态的选择
健康细胞：
使用健康、处于对数生长期的细胞进行实验，以提高转染效率和沉默效果。
避免使用老化、凋亡或病变的细胞进行实验。
七、实验设计的合理性
1.重复实验：
每个实验条件应设置至少3个重复孔或重复实验，以提高实验结果的可靠性和重复性。
2.数据分析：
使用合适的统计方法对实验数据进行分析，确保结果的准确性和可靠性。
