蛋白质分子量大小对Western Blotting结果有显著影响。以下是对这一观点的详细解释：
一、分子量大小对电泳迁移的影响
1.小分子蛋白的弥散趋势：
分子量越小的蛋白在SDS-PAGE电泳中越容易呈现向四周弥散的趋势。这是因为小分子蛋白所能结合到的SDS较少，在电场作用下，蛋白向前迁移时会更容易弥散，导致最终可能呈现不出清晰的蛋白条带。
2.凝胶浓度的选择：
为了更好地分离小分子蛋白，通常需要使用高浓度的凝胶。例如，对于20kDa以下的蛋白，建议选择15%以上的凝胶浓度。高浓度凝胶中的丙烯酰胺链条更紧密，间隙更小，能够更好地分离不同大小的蛋白分子。
二、分子量大小对转膜的影响
1.小分子蛋白的转膜难度：
小分子蛋白在转膜过程中更容易穿透PVDF膜，尤其是当膜孔径较大（如0.45μm）时。因此，对于小分子蛋白，通常建议选择0.22μm的PVDF膜，以减少穿透现象。在穿透严重时，可以考虑使用两张0.22μm膜叠加使用。
2.转膜条件的优化：
为了防止小分子蛋白在转膜过程中穿透膜或过度弥散，可以适当减少转膜时间和降低转膜的电压电流。通常建议的转膜条件为200mA-250mA转15-30分钟。
三、分子量大小对抗体结合的影响
1.抗体识别的特异性：
不同分子量的蛋白在结构上存在差异，这可能导致抗体识别的特异性有所不同。因此，在选择抗体时，需要根据目标蛋白的分子量来选择合适的抗体。
2.非特异性结合的可能性：
小分子蛋白由于带电荷量相对较少，吸附能力较弱，因此更容易发生非特异性结合。为了减少非特异性结合，可以在孵育抗体前使用封闭液对膜进行封闭处理。
四、实验操作的注意事项
1.电泳条件的优化：
为了减少小分子蛋白在电泳过程中的弥散程度，可以缩短电泳的距离并确保目的蛋白和内参能够区分开。同时，电泳过程中需要注意降温以防止温度升高加快小蛋白分子的运动速度。
2.样品处理的重要性：
对于小分子蛋白来说，由于其在细胞中的含量通常较低且容易降解，因此在样品处理过程中需要特别注意避免蛋白的丢失和降解。例如，可以选择合适的蛋白提取方法并使用蛋白稳定剂来保护小分子蛋白。
综上所述，蛋白质分子量大小对Western Blotting结果具有显著影响。在实验过程中，需要根据目标蛋白的分子量来选择合适的凝胶浓度、PVDF膜孔径以及转膜条件等参数，以确保获得准确可靠的实验结果。
