小分子量蛋白在Western Blotting（WB）实验中由于其分子小、含量低、易弥散等特点，往往增加了实验的难度。为了确保小分子量蛋白WB实验的成功，以下是一些关键因素需要注意：
一、样品制备与上样
1.提高上样量：
通常Western Blot每孔上样量为3050μg，但对于小分子量蛋白，由于其含量较低，建议增加上样量至50100μg，甚至更多，以确保有足够的蛋白被检测到。
2.选择合适的蛋白Marker：
使用适用于小分子蛋白的Marker，以便在电泳和转膜过程中更准确地判断目的蛋白的位置。
二、凝胶电泳
1.配置高浓度凝胶：
小分子量蛋白需要配置高浓度的分离胶，一般推荐12%~15%的分离胶浓度，以更好地分离小分子蛋白条带。
2.1优化电泳条件：
采用较低的电压进行浓缩胶电泳，如7080V，时间约30分钟，以确保蛋白能够充分浓缩到一条线上。随后提高电压至100110V进行分离胶电泳，直至所需蛋白区域全部分开。同时，注意电泳过程中的降温，以防止蛋白降解。
三、转膜
1.选择合适的PVDF膜：
对于小分子量蛋白，推荐使用0.2μm或0.22μm的PVDF膜，以减少蛋白在转膜过程中的穿透现象。同时，PVDF膜使用前需要在甲醇中浸泡5分钟以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白质结合。
2.优化转膜条件：
采用湿转法，并根据蛋白分子量调整转膜电流和时间。对于小分子量蛋白，通常采用恒流200mA转膜30~40分钟。注意转膜前的平衡时间短一些，几分钟甚至1分钟即可，平衡液和转膜液成分相同，不要加SDS。
四、抗体孵育与检测
1.选择低稀释比例的一抗：
对于小分子量蛋白，一抗应选择较低的稀释比例，以增加抗体与蛋白的结合机会。同时，确保抗体在有效期内使用，并避免长时间放置导致抗体活性降低。
2.优化孵育条件：
确保抗体与膜充分接触，并适当延长孵育时间以增加抗体结合效率。同时，注意控制孵育温度，避免过高或过低影响抗体结合。
3.严格洗涤步骤：
在孵育抗体后，使用适量的洗涤缓冲液对膜进行充分洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合的背景信号。洗涤时间和次数应根据实际情况进行调整。
4.显影与曝光：
根据信号的强弱适当调整曝光时间。如果信号较弱，可以适当延长曝光时间或重新滴加显影液进行二次曝光以获得清晰的条带。同时，注意控制显影液和定影液的使用时间和浓度。
五、其他注意事项
1.避免污染：
在整个实验过程中要注意避免污染，确保所有试剂和器材的清洁和无菌。
2.设置阳性对照和阴性对照：
通过设置阳性对照和阴性对照来验证实验系统的有效性和特异性。
3.记录实验条件：
详细记录实验条件如凝胶浓度、电泳电压和时间、转膜电流和时间、抗体稀释比例和孵育条件等，以便后续分析和复现实验结果。
综上所述，小分子量蛋白成功做好WB实验需要综合考虑样品制备、凝胶电泳、转膜、抗体孵育与检测等多个方面的因素。通过优化这些关键因素的条件，可以提高小分子量蛋白在WB实验中的检测灵敏度和准确性。
