小分子量蛋白在Western Blotting（WB）实验中由于其特有的性质，如分子量小、易降解、易弥散等，往往增加了实验的难度。为了确保小分子量蛋白WB实验的成功，以下是一些关键的技巧：

一、样品制备

1.增加上样量：

通常，Western Blot实验中每孔的上样量为3050μg。但对于小分子量蛋白，由于其含量较低，建议增加上样量至50100μg，甚至更多，以确保有足够的蛋白被检测到。

2.使用新鲜样本：

使用新鲜样本进行实验，避免蛋白降解。在样本制备过程中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以防止蛋白在提取过程中降解。

3.充分裂解样品：

在制样过程中增加超声处理，以充分裂解样品并暴露抗原表位，提高抗体与蛋白的结合效率。

二、凝胶电泳

1.配置高浓度凝胶：

小分子量蛋白需要配置高浓度的分离胶，一般推荐12%~15%的分离胶浓度，以更好地分离小分子蛋白条带。浓缩胶的比例可以适当增加到4:6，使其充分浓缩，后续电泳过程中一定程度上可以减少弥散。

2.选择合适的电泳电压：

小分子量蛋白在电泳过程中应采用低电压，以避免蛋白弥散和锯齿状条带的出现。建议浓缩胶用7080V电泳30分钟左右，之后调成100110V，溴酚蓝跑到距胶底1cm以上就停下。也可以尝试用恒流进行电泳，浓缩胶推荐30mA，分离胶推荐45mA。

3.控制电泳温度：

电泳过程中注意控制温度，避免温度升高导致蛋白运动速率增加，从而加剧蛋白的弥散现象。

三、转膜

1.选择合适的PVDF膜：

对于小分子量蛋白，推荐使用0.2μm或0.22μm的PVDF膜，以减少蛋白在转膜过程中的穿透现象。同时，确保PVDF膜在使用前经过甲醇活化处理。

2.优化转膜条件：

采用湿转法，并根据蛋白分子量调整转膜电流和时间。对于小分子量蛋白，通常采用恒流200mA转膜30~45分钟。注意转膜前的平衡时间短一些，几分钟甚至1分钟即可，平衡液和转膜液成分相同，不要加SDS。

3.防止蛋白穿透：

在转膜液中加入适量的甲醇（10%~30%），可以改善小分子蛋白与PVDF膜的吸附能力，防止蛋白穿透膜。

四、抗体孵育与检测

1.选择低稀释比例的一抗：

对于小分子量蛋白，一抗应选择较低的稀释比例，以增加抗体与蛋白的结合机会。同时，确保抗体在有效期内使用，并避免长时间放置导致抗体活性降低。

2.优化孵育条件：

确保抗体与膜充分接触，并适当延长孵育时间以增加抗体结合效率。通常，一抗孵育时间可以在4°C下至少8~9小时。

3.严格洗涤步骤：

在孵育抗体后，使用适量的洗涤缓冲液对膜进行充分洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合的背景信号。洗涤时间和次数应根据实际情况进行调整。

4.显影与曝光：

根据信号的强弱适当调整曝光时间。如果信号较弱，可以适当延长曝光时间或重新滴加显影液进行二次曝光以获得清晰的条带。同时，注意控制显影液和定影液的使用时间和浓度。

五、其他注意事项

1.避免污染：

在整个实验过程中要注意避免污染，确保所有试剂和器材的清洁和无菌。

2.设置阳性对照和阴性对照：

通过设置阳性对照和阴性对照来验证实验系统的有效性和特异性。

3.记录实验条件：

详细记录实验条件如凝胶浓度、电泳电压和时间、转膜电流和时间、抗体稀释比例和孵育条件等，以便后续分析和复现实验结果。

综上所述，小分子量蛋白成功做好WB实验需要综合考虑样品制备、凝胶电泳、转膜、抗体孵育与检测等多个方面的技巧。通过优化这些关键因素的条件和步骤，可以提高小分子量蛋白在WB实验中的检测灵敏度和准确性。