在Western Blotting实验中，将PVDF膜叠在一起孵育一抗是不推荐的做法，因为这可能会影响实验结果。以下是对此问题的详细分析：
1.抗体结合效率：当PVDF膜叠在一起时，膜与膜之间可能会产生接触，导致抗体无法均匀渗透到所有膜的表面。这会影响抗体与目标蛋白的结合效率，使得某些区域的蛋白无法被充分标记。
2.背景信号增加：叠放的PVDF膜之间可能存在微小的气泡或间隙，这些区域在孵育过程中可能会成为非特异性结合的位点，导致背景信号增加。高背景信号会干扰对目标蛋白条带的观察和分析。
3.结果解释困难：由于叠放的PVDF膜在孵育过程中可能产生不均匀的抗体结合，因此实验结果可能会出现模糊、不清晰的条带。这将使得对结果的解释变得困难，甚至可能导致实验结论的误判。
为了确保Western Blotting实验的准确性和可靠性，建议采取以下措施：
1.单独孵育每张膜：确保每张PVDF膜都能与抗体充分接触，从而提高抗体结合效率。
2.使用适量的抗体：根据膜的大小和蛋白的丰度，使用适量的抗体进行孵育，以确保目标蛋白能被充分标记。
3.严格洗涤步骤：在孵育抗体后，使用适量的洗涤缓冲液对膜进行充分洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合的背景信号。
综上所述，把PVDF膜叠在一起孵育一抗会影响实验效果，因此不推荐这种做法。在实验中，应确保每张膜都能单独、均匀地与抗体接触，以获得准确、可靠的实验结果。
