从新鲜组织中制备高活性和高质量的单细胞悬液是单细胞转录组测序（scRNA-seq）至关重要的一步，很多单细胞实验折戟在此。常见的问题诸如细胞活性低，细胞背景不干净，细胞碎片多，细胞结团率高等。

样本制备成为限制单细胞技术广泛应用的一大障碍，也是科研服务公司和广大科研工作者面临的主要难题。

本次给大家介绍的是心脏单细胞悬液制备的解离实验

一、心脏组织背景介绍

心脏是一中空的肌性器官，是血液循环的动力器官，主要由心肌构成，有四个腔，包括：左心房、左心室、右心房、右心室，左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜，这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，细胞之间有闰盘结构，该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接。心肌细胞之间细胞外基质成分的分布和排列是一个多层次、多方位的网络结构，称为心肌基质网络。这个网络结构主要由心肌纤维间隙中的成纤维细胞合成和分泌的I型和III型胶原蛋白形成的纤维组成，其中大部分是I型胶原蛋白形成的粗纤维，伸展和回弹性较小，而III型胶原蛋白形成的细纤维伸展和回弹性均较大。这两种纤维组成的网络不仅包绕每个心肌细胞，也连接相邻的心肌细胞、心肌细胞群和毛细血管。综上，心脏组织含大量胶原蛋白，本次解离主要使用罗氏Liberase TL酶，其中含胶原酶和中性蛋白酶，可提高心脏组织解离的质量和可重复性，并提高细胞活力和功能。此外，心脏细胞解离时多建议抽核，主要原因是成体心肌细胞体积大（长杆状，长100-150 μm, 宽20~30 μm）， 远超过常规体细胞（近球形，直径<30 μm），目前主流的商用单细胞平台都难以捕获此类大细胞。

心脏组织示意图

二、材料和试剂耗材

1. 试剂耗材

2. 溶液配制

三、实验流程
1. 将组织转移到含有 1 mL DPBS的培养皿中，在不损坏心包层的情况下小心地清除脂肪等非目标组织。
2. 使用手术刀将组织切碎成大约2 mm的小块，大约200 mg。
3. 切碎的组织转移到装有消化缓冲液的1.5 mL EP管，尽量减少DPBS带入，用封口膜密封EP管。
4. 将EP管放入水浴中，并在37℃下搅拌消化15 min，每5 min从水浴中取出并用手轻轻摇晃。
5. 消化完成后，将EP管放在冰上，并用5 mL移液管吹打。上下吹打 5-10 次。
6. 通过100 µm细胞过滤器过滤溶液。使用1 mL柱塞通过过滤器轻轻搅动组织。用8.5 mL DMEM洗涤过滤器至终体积为10 mL的细胞悬液。
7. 如果样品加到Chromium控制器中，则使用70 µm滤膜过滤溶液，用另外5 mL DMEM 清洗滤膜。
8. 300 g，4℃离心5 min。
9. 弃去上清液，用10 mL DPBS + 2 % FBS清洗沉淀，加入2.86 mL Percoll 溶液，制成27 % Percoll-cell 溶液，将溶液转移到高速离心管中并准备平衡管。
10. 在4℃下以15000 g离心20 min，中断选项设置为4（或减速）。
11. 使用1 mL移液器收集细胞，在DPBS + 0.04 % BSA中清洗细胞，并重悬在100 μL DPBS + 0.04 % BSA中。
12. 取适量悬液加入染色缓冲液（AO/PI或者台盼蓝）评估细胞活力，调整浓度并继续执行10X操作 。
 

心脏组织解离大多情况需抽核，核分离流程如下：
1. 从储藏室中取出切碎的组织并置于干冰上。
2. 将组织块转移到预冷的Dounce匀浆器 （7 mL）中并加入3 mL HB。用松杵8次敲击和紧杵8次敲击均质。保持在冰上以避免加热。如果均质化不完全，需添加敲击次数（取决于组织的数量）。
3. 将匀浆的组织通过40 μm细胞过滤器过滤到50 mL管中，用2× 1 mL额外的 HB清洗均质器。
4. 在4℃下，以500 g离心5 min以获得细胞核沉淀，完全去除上清液。
5. 将细胞核沉淀重新悬浮在1 mL SB中，用2滴 NucBlue 染色悬浮液，等待10 min染色。
6. 继续进行流式细胞仪分选到带有200 μL SB 的 EPPi管中，设置gates以选择DAPI染色的细胞核。排除小于1 µm的颗粒，以去除小碎片和损坏的原子核，排除双峰和不规则形状的碎片。
7. 将分选的细胞核以500 g的速度在4℃下离心5 min以获得颗粒，完全去除上清液，在100 μL SB中重悬。
8. 使用Countess和台盼蓝对细胞核进行4次计数。调整浓度并继续加载到10X芯片。

四、结果展示
所获细胞核悬液结团率低，背景干净。

注：心肌细胞形态较大，一般采用提取细胞核的方式进行单细胞研究。