细胞焦亡（Pyroptosis）是一种炎症程序性细胞死亡，依赖于gasdermin蛋白家族的激活以促使细胞膜穿孔，导致细胞内容物泄露，尤其是大量炎症因子，进而引发炎症反应。人类gasdermin蛋白家族成员主要包括gasdermin A/B/C/D/E（GSDM A/B/C/D/E）和DFNB59，其中GSDMD和GSDME在焦亡中研究最为深入。除DFNB59外，其他成员的N端都具有一个保守的成孔结构域，可诱导细胞焦亡。重要的是，细胞焦亡广泛影响着多种疾病发生发展，包括心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病、感染性疾病等等，因此准确检测细胞焦亡的发生对于理解其生理和病理意义至关重要。今天则为大家介绍下检测细胞焦亡的重要指标及检测方法。
介绍焦亡指标及检测方法前，我们先了解一下目前细胞焦亡的相关机制以及焦亡的特征，以便于更好地理解如何去做检测。
1. 细胞焦亡的机制
现阶段发现诱导细胞焦亡的机制主要分为经典的Caspase-1依赖途径和非经典的Caspase-4/5/11、Caspase-3/8依赖途径，它们通过切割不同的gasdermin蛋白来诱导焦亡。
图1 细胞焦亡机制[1]
1.1 经典途径（Caspase-1依赖途径）
经典途径通常涉及炎症小体（Inflammasomes）的激活，包括NLRP3、NLRC4、AIM2等。炎症小体由病原体相关分子模式（PAMPs）或危险相关分子模式（DAMPs）激活，随后裂解并活化pro-Caspase-1，形成具有活性的Caspase-1。Caspase-1一方面可切割GSDMD，产生GSDMD的N段片段（GSDMD-NT），该片段会在细胞膜上形成孔洞，导致细胞膜穿孔而逐渐破裂；另一方面，Caspase-1还能够切割并活化Pro-IL-1β和Pro-IL-18，形成成熟的炎症因子IL-1β和IL-18并释放到胞外，从而引发炎症反应。
1.2 非经典途径
（1）Caspase-4/5/11依赖途径
非经典途径通常由细胞内的脂多糖（LPS）直接激活。这一途径中，Caspase-4、Caspase-5（人源）和Caspase-11（小鼠）直接被LPS激活，而不需要炎症小体的参与。Caspase-4/5/11被激活后同样可以活化GSDMD，使细胞膜破裂。Caspase-11还可以通过激活NLRP3炎症小体间接促进Caspase-1的活化，促进IL-1β和IL-18的成熟与释放。
（2）Caspase-3/8介导的途径
Caspase-3和Caspase-8通常是参与凋亡的关键酶，但近年来的研究也揭示它们在焦亡中作用。Caspase-3和Caspase-8分别通过切割GSDME和GSDMC，产生GSDME-NT和GSDMC-NT来触发细胞焦亡。
2. 细胞焦亡的主要特征
（1）细胞形态学变化：细胞肿胀膨大，早期可观察到细胞膜出现大量1-2nm的孔洞，随着焦亡的进展最终导致细胞膜破裂。
（2）分子特征变化：DNA分子断裂；Caspase-1、GSDMD等相关炎症因子表达水平及活性显著增加，胞外IL-1β和IL-18水平增加。
3. 细胞焦亡的检测指标及方法
根据细胞焦亡的机制及特征，可通过细胞形态、细胞活力、焦亡相关标志物的表达和炎症因子水平等不同的指标来判断焦亡的发生，以及区别于其他细胞死亡。
3.1 细胞形态
采用扫描电镜和透射电镜观察细胞，更推荐扫描电镜，可清晰地观察细胞表面结构。发生焦亡的细胞表面能观察到许多明显的小孔（图2 D），且细胞体积增大（图2 B）；透射电镜可观察到细胞边缘有凹陷的小孔（图3 B），部分膜区域断裂（图3 E）。
图2 细胞焦亡扫描电镜[2]
图3 细胞焦亡透射电镜[2]
3.2 细胞活力
（1）可采用CCK-8试剂盒等检测细胞活力；
（2）Tunel染色验证焦亡细胞中的DNA断裂；
（3）流式细胞术，通过Annexin V/PI染色检测细胞膜、核膜通透性，发生焦亡的细胞通常Annexin V和PI均为阳性。
图4 细胞焦亡流式结果[2]
3.3 细胞焦亡相关标志物
NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18、IL-18等等这些都是涉及焦亡的相关分子，可通过western blot、免疫荧光等方法检测它们的表达水平。
3.4 炎症相关因子检测
主要是检测IL-1β和IL-18的分泌。检测胞内表达后，可进一步通过ELISA分析胞外的水平，验证细胞焦亡的发生。另外，检测胞外的LDH水平也能有助于反映细胞焦亡。
图5 细胞焦亡、凋亡、坏死的形态[3]
参考文献：
[1] Yu P, Zhang X, Liu N, Tang L, Peng C, Chen X. Pyroptosis: mechanisms and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):128. Published 2021 Mar 29. doi:10.1038/s41392-021-00507-5
[2] Herr DR, Yam TYA, Tan WSD, et al. Ultrastructural Characteristics of DHA-Induced Pyroptosis. Neuromolecular Med. 2020;22(2):293-303. doi:10.1007/s12017-019-08586-y
[3] Wang S, Liu Y, Zhang L, Sun Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 2021 Dec 22;19(4):398–414. doi: 10.20892/j.issn.2095-3941.2021.0504.
[4] Bergsbaken T, Fink SL, Cookson BT. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 2009 Feb;7(2):99-109. doi: 10.1038/nrmicro2070.
