实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。
载基采用SYBR荧光染料法进行荧光定量PCR检测，从引物设计到检测一次性完成，提供2种常用的内参引物及免费的专业数据分析，每个样品设置至少三个平行对照，保证结果的准确可靠。
一、实验流程：
二、实验步骤：
RNA提取
1) 细胞样本中加入0.5 mL NucleoZol，吹打混匀，静置3 min。
2) 加入 200 μL RNase-free 的水（每 500 μL NucleoZOL）到裂解物中。大力摇晃样本 15 s。室温孵育 15 min。12,000 x g 室温离心 15min。
3) 从步骤 2移取含 RNA 上清到一新管。 500μL 裂解物中加入 500μL 异丙醇，混匀后室温孵育 10min。12,000 x g 室温离心 10 min, 弃上清。
4) 加入 500 μL75%乙醇，8000 x g 室温离心 3min。弃上清，重复乙醇清洗步骤。洗涤过程中不要使 RNA 团干掉。
5) 用 RNase-free water 重悬 RNA 团，使获得的 RNA 浓度在 1–2 μg/μL。利用 Vortex 室温涡旋 3 min，有效溶解样品。
6）取2 μL检测RNA浓度，余下样品迅速置于-80 ℃保存备用。
cDNA合成（mRNA）
反转录体系（20 μL）：
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RNA |
X μL（1 μg） |
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RNase free ddH2O |
Y μL |
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5×Reaction Buffer |
4 μL |
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Oligo(dT) |
0.5 μL |
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Random Hexamer Primer |
0.5 μL |
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SweScript RT I Enzyme Mix |
1 μL |
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Total |
20 μL |
按上面所写添加试剂，微离心10 s混匀，25 ℃ 5 min，50 ℃ 30 min；85 ℃ 5 s。
qPCR扩增反应
cDNA稀释5倍，β-actin作为内参基因，检测基因的相对表达量。
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β-actin |
FORWARD |
TGACGTGGACATCCGCAAAG |
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β-actin |
REVERSE |
CTGGAAGGTGGACAGCGAGG |
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mRNA |
FORWARD |
引物序列 |
|
mRNA |
REVERSE |
引物序列 |
real-time PCR 反应体系
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反应原料 |
反应体系 |
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2x SYBR qPCR Master Mix |
10.0 µL |
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Primer 1 (10 µM) |
1.0 µL |
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Primer 2 (10 µM) |
1.0µL |
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模板 DNA |
2.0µL |
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灭菌蒸馏水 |
Up to 20 µL |
qPCR程序设置
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Stage1 预变性 |
Reps: 1 |
95℃ |
5min |
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Stage2 变性退火延伸 |
Reps: 40 |
95℃ |
10sec |
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60℃ |
30sec |
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72℃ |
30sec |
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Stage3 溶解曲线 |
Reps: 1 |
95℃ |
15sec |
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60℃ |
60sec |
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95℃ |
15sec |
根据 2-ΔΔCt 法对数据进行相对定量分析，计算公式如下（x表示任意一个样本）：ΔΔCt = (Ct.Target – Ct.内参)X – (Ct.Target – Ct.内参)Control。
三、实验结果：
