qPCR，即实时荧光定量PCR，通过荧光染料或者荧光探针与目的DNA结合，仪器检测DNA扩增每一个循环的荧光信号变化，从而定量扩增过程，判定样本起始浓度高低。

qPCR可进行相对定量计算基因相对表达量或绝对定量计算拷贝数，另外也可进行基因分型，已经成为现在分子生物学中不可缺少的一门普遍的实验技术。

qPCR操作过程其实过程不难，与PCR的过程也大致类似，都是配体系，上机，调整程序等一系列过程，最后获取结果。

但对于初次做的小伙伴来说，一份详细的操作指南还是很有必要的，接下来我们一起看看qPCR是如何做出来的吧！

一．实验准备

1.器材：超净台，移液枪，无酶枪头，八联管及管盖，EP管，八连管架。

2.试剂：qPCR Mix，引物，DEPC水，稀释好的cDNA。

3.计算：根据实验组对照组，样品数，基因数量设计好96孔板上的排板布局，一般同一个基因做至少3个重复放置于同一横排，方便计算取平均值。一个基因同时也要保证至少3组生物学重复。目的基因中，通常至少包含一个内参基因，例如GAPDH或者β-actin。后面进行数据处理时，内参基因将作为参考值，用于计算相对表达量。

要加的孔数=样品数x目的基因数x3重复，例如：有3个样品，5个目的基因（包括内参），那么要加的孔数是3x5x3=45个。

                                                            图1: 96孔板排布方式

二．配置反应体系

1. 枪头和板子可提前放入冰箱预冷可有效减少气泡产生；

2. 提前从冰箱里面取出引物，qPCR mix，cDNA，置于冰上化冻；

3. 等待的时间根据布局计算试剂用量：每12孔多计算2个孔，这里以20ul反应体系为例，若做10ul小体系，则每种组分体积减半即可，但小体系对于操作的误差容错更低，对于保证重复性会更有难度；

                                              表1：反应体系计算。

4. cDNA按需稀释5-10倍；

5. 配置预混试剂：qPCR mix使用前确保解冻完全，观察是否有沉淀，若有沉淀需颠倒混匀；

6. 引物要多次涡旋离心防止形成引物二聚体；

7. 在八连管架上放置好八连管，分大样时枪头尽量在液体表面，依次放入qPCR Mix，引物+水，cDNA；

8. 确保所有试剂均未挂壁后盖上盖子，在盖子的头尾做上标记，离心混匀至无气泡。

三．上机操作

1. 使用八连管时，建议对称放置样品，从中间逐步向两边放置，保证热盖压下来时不易发生倾斜，每管受力受热均匀，提高孔间条件一致性，上机前先设置程序，具体如下：设置反应类型，孔板信息，参考试剂说明书设置反应温度和时间设置反应温度和时间（特别关注采集信号开关是否打开，见下图），开始反应，大概一个半小时会出结果。

                                                  图2：反应程序设置界面

2. 推荐仪器校准频率：定期（一般1年）进行仪器校准保养。

原因：仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。

3. 导出数据

反应结束后得到qPCR数据，根据熔解曲线是否为单峰，扩增曲线是否是正常的“S”型曲线，查看数据的有效性，导出数据为EXCEL文件并保存。

                                                                     图3：标准的扩增曲线与熔解曲线

四．实验结束

实验完毕，打开qPCR仪，取出八连排管，盖上qPCR仪，关闭电脑，仪器。

五．数据分析和计算

1. 相对定量法中常见的是比较Ct法，其中主要包括△△Ct法，Pfaffl法和△CT法，目前诸多科研人员采用最多的是△△Ct法。我们在实际做实验的时候，也要注意内参基因和目的基因所对应的扩增效率控制在接近100%或者基本一致，否则△△Ct法得出的结果和实际情况会有出入。

2. 如上表格，若内参基因和目的基因扩增效率上未控制在基本一致或接近100%，则在使用△△Ct法上会有一定的偏差风险。

3. 根据△△Ct法处理数据，计算相对表达量，Graphpad Prism作柱状图。