免疫印迹（Western blot, WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。
WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loading control）。
一、为何要选用内参
在Western Blotting中使用内参就是在试验中另外用内参对应的抗体检测内参蛋白。
内参就是内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照。
二、如何选择内参抗体
1.样本种属来源
选择内参首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase, Histone H3等。植物来源实验样本，则可以选择Plant actin、Rubisco等。其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。
2.目的蛋白分子量
选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。
3.目的蛋白表达部位
就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。
内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。比如在在凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。
三、常用内参抗体
常用内参抗体分子量及其定位情况如下：
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内参名称 |
分子量大小 |
适用范围 |
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Beta-actin |
43KDa |
胞浆和全细胞 |
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GAPDH |
36KDa |
胞浆和全细胞 |
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Tubulin |
55KDa |
胞浆和全细胞 |
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Histone H3 |
16KDa |
细胞核 |
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COXIV |
16KDa |
线粒体 |
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Lamin B1 |
67KDa |
细胞核（不适于去除核膜的样本） |
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TBP |
38KDa |
细胞核（不适于去除DNA的样本） |
1.β-Actin
Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42KD左右。
2.Tubulin
Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin实际检测条带均在55kDa左右。作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
3.GAPDH
GAPDH即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步,它还参与核转录等事件,核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western Blotting的内参。请注意,某些生理因素,如缺氧和糖尿病,会增加GAPDH在特定的细胞和组织的表达。
4.Lamin B
Lamin B即核纤层蛋白B, 是凋亡关键因素Caspase家族的作用靶子，受Caspase 的剪切而活化，位于核膜。其由586个氨基酸组成，分子量为67KD。
5.Na+/K+-ATPase
Na+/K+-ATPase即Na+/K+-ATP酶或Na+/K+-ATP泵，它会使细胞外的Na+浓度高于细胞内，当Na+顺着浓度差进入细胞时，会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物质以共同运输的方式带入细胞。其由1023个氨基酸组成，分子量为113KD。
四、内参蛋白的上样量
内参蛋白的选择相对容易，那如何选择内参蛋白的上样量，保证WB的结果真实可信呢？有文献报道总蛋白上样量超过10 μg时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异；所以一般情况下内参的理想上样量为大约5μg。对于目标蛋白的上样量，其理想的上样量为为10-20μg。
如β-Actin是一种定位于细胞质的常用内参，使用HzAm1细胞裂解液上样4-40μg，PVDF膜ECL显色结果惊奇的发现：上样总蛋白质超过4μg时β-Actin几乎无变化。
使用生物学软件分析蛋白相对表达量发现，上样总蛋白质超过4μg时β-Actin的相对表达量无明显增加。
上述结果说明使用β-Actin重新探测相同的膜以达到数据标准化的目的的传统做法应该受到质疑。那么为什么会出现上述现象呢？这种现象可归因于β-Actin的丰度，β-Actin丰度远远高于细胞中的大多数其他蛋白质。结果导致β-Actin经常超载，特别是在检测低丰度蛋白质时无法区分蛋白质上样量的差异。
结语：内参可以监测整个实验体系是否正常，同时可作为目的蛋白上样量和相对表达量的参考，所以，正确选用内参抗体非常重要；另外，内参抗体在线性范围内才能够很好的反应蛋白上样量，因此上样量无论对于内参还是目标蛋白均很重要，所以，合适的上样量同样非常重要。
