蛋白样品制备是免疫印迹（western blotting）的第一步,也是决定实验成败的关键步骤。在蛋白提取和定量后，就需要加入蛋白上样缓冲液(Loading buffer)对蛋白进行处理，使蛋白样品能在接下来的电泳中分离。

目前的蛋白上样缓冲液主要为还原（变性）蛋白上样缓冲液和非还原（非变性）蛋白上样缓冲液。

SDS-PAGE：

变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS以及巯基乙醇，让蛋白质的高级结构完全瓦解，被严重蹂躏，变成直线棒状的蛋白质会在电场的作用下，在PAGE的网孔中穿梭向前跑，那些个头越小跑得速度越快，个头越大受到的阻力越大，跑得越慢，那么组织或者细胞的蛋白质就会在PAGE的跑道上依次排开，蛋白质就可以通过已知的分子量个头大小进行分析。

一般的抗体只能识别抗原蛋白中的线性序列结构表位（一级结构），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构(除抗体说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性蛋白样品)。还原（变性）蛋白上样缓冲液含有可完全消除蛋白高级结构的必需试剂。

缓冲液中含有的SDS可断裂蛋白分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，同时SDS也与蛋白疏水区结合，由于SDS带大量的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使其均带有相同密度的负电荷。缓冲液中的强还原剂DTT则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，分子被解聚成组成它们的多肽链。

缓冲液中还含有甘油，确保上样后蛋白样本沉积在点样孔中。溴缓冲液中的酚蓝染料呈蓝色，且分子量比绝大部分蛋白质小，电泳中比其他蛋白质移动速度快，可监控电泳进程。加入还原（变性）蛋白上样缓冲液的蛋白样品最后需100℃水浴5分钟变性。

Native-PAGE：

不含SDS、巯基乙醇

蛋白质依然保持三维结构

非变性凝胶电泳,也称为天然凝胶电泳,可以使蛋白质保持其天然的形状和电荷,与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性，所以亚基、高级结构都保留下来。

某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要使用非变性蛋白样品进行电泳，抗体的说明书一般会标注。非还原（非变性）蛋白上样缓冲液不加SDS和DTT，蛋白样本也不需煮沸变性。

一、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液1X（变性）/ 2X（变性）/ 5X（变性）

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液适合用于变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳前的蛋白样本处理。一般电泳每孔上样量为20ul,样品蛋白量不小于20ug，如蛋白样品浓度小，可使用5 X蛋白上样缓冲液；反之可使用2X蛋白上样缓冲液。

1.按照1体积蛋白样品加入1体积SDS-PAGE蛋白上样缓冲液2X（变性）即1：1的比例混合；或4体积蛋白样品加入1体积SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X（变性）即4：1的比例混合，经100℃水浴变性5分钟后即可上样，电泳。

2.通常电泳到当溴酚蓝染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。

二、双色蛋白上样缓冲液4X（变性）

双色蛋白上样缓冲液4X（变性）适用于SDS-PAGE电泳前的蛋白样本处理。该优化上样缓冲液可以保护蛋白样本在SDS-PAGE上样前加热处理和电泳过程中不被降解。该上样缓冲液含有的两种示踪染料可监控电泳进程，分别是蓝色和粉红色，此外粉红色染料还可以监控蛋白转膜效率。

1.按照1体积蛋白样品加入1体积双色蛋白上样缓冲液4X（变性）即3：1的比例混合，经100℃水浴变性5分钟后即可上样，电泳。

2.通常电泳到当染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。

三、SDS-PAGE Tricine蛋白上样缓冲液2X（变性）

SDS-PAGE Tricine蛋白上样缓冲液适合用于多肽和小蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳前的蛋白样本处理。

1.按照1体积蛋白样品加入1体积SDS-PAGE Tricine蛋白上样缓冲液2X（变性）即1：1的比例混合，经100℃水浴变性5分钟后即可上样，电泳。

2.通常电泳到当溴酚蓝染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。

四、蛋白上样缓冲液2X（非变性）

蛋白上样缓冲液2X（非变性）适用于非变性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳前的蛋白样本处理。

1.按照1体积蛋白样品加入1体积蛋白上样缓冲液即1：1的比例混合，即可上样，电泳。

2.通常电泳到当溴酚蓝染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。