一、实验动物：
ICR，4-6W
二、实验器材：
手术剪、手术镊、玻璃皿、泵、注射器、一次性静脉输液器
三、实验步骤：
1.先注射0.5ml肝素钠，再注射0.3ml 15%水合氯醛，将小鼠麻醉，同时防止凝血。
2.酒精消毒，用手术剪剪开小鼠皮肤，暴露腹腔，可见鲜红的肝脏，将肠挪到右侧，胰腺也挪到右侧，暴露出下方静脉血管（门静脉），再找到中间偏左腹腔静脉（下腔静脉）。
3.右手取静脉注射针平插入门静脉远端，左手用镊子夹住针头及血管，防止其脱落，右手轻轻的松开，左手保持不动，启动泵，开始导入预热至37度的无钙灌流液（G2），待充盈立起来（有的肝不明显），右手持手术剪剪断下腔静脉，放流，使血液和灌流液流出。
可观察到肝叶垂下来，然后右手持镊子夹住下腔静脉，停止放流。慢慢地，肝叶又充盈立起来，待肝叶完全立起来后，右手的镊子松开，放流，这个过程不断循环，一般需要灌50-60ml。可观察到肝叶逐渐肿胀变为淡黄色，肝叶立起来的现象渐渐不明显。
4.待下腔静脉流出液接近无钙灌流液，用注射器吸取5-6ml胶原酶1稀释液（G3），接入灌肝装置，慢慢推入，尽量控制五分钟左右推完。
整个期间，左手镊子一直夹住静脉插针和血管，不能松开而使静脉针脱落。（此过程需要另一个人协助完成）
5.肉眼观察到肝叶表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙、组织呈弥散状时判断肝脏已被消化充分，可以终止灌流 。
6.小心剪下整个肝，放入含有基础培养基的玻璃皿内，过程要慢，轻柔。从肝叶中间轻轻撕开轻甩一下，能观察到有肝细胞掉下来。
7.吸取少量液体，台盼蓝染色，在显微镜下观察肝细胞状态及数量。
8.加入DF-12完全培养基终止胶原酶消化，用镊子撕开肝组织，轻甩，吸取液体，300r/min，5min。
9.接种，DF-12，双抗，密度控制好。
四、试剂配置
试剂 浓度（g/L） 终浓度
HEPEs 1M 5mM
EDTA 0.5M 0.5mM
Vc 10ug/ml 0.1ug/ml
CaCl2 1M 5mM
Col Ⅰ 150mg 5mg/ml
肝素钠 50u/ml
1.HBSS (1L)：
NaCl KCl 葡萄糖 KH2HPO4 Na2HPO4 HEPEs
8.0g 0.4g 1g 60mg 47.5mg 1.2g
2.G2液：
HBSS、EDTA（0.5mM）、Vc(0.1ug/ml)
3.G3液：
HBSS、CaCl2（5mM）、Col Ⅰ（5mg/ml）
4.Col Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ母液（过滤除菌）：
2%：称1g溶于50ml的1x PBS
5.肝素钠（过滤除菌）：
使用时的最终浓度为50 u/ml，用纯水/生理盐水/PBS稀释。可提前配好100x 母液
6、15%水合氯醛：
称取15g溶于100ml H2O
