1. 取50 μl血样于离心管中,加PBS缓冲液至1.5mL,轻轻地摇匀。冷冻离心机6500 rpm离心10 min,去掉上清液,保留沉淀物。重复洗2次。
2. 向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl,15 μl的蛋白酶K,混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。
3. 将消化过夜的反应液冷却至室温,加入等体积冰冷的饱和酚溶液,盖紧离心管盖,缓慢地来回颠倒10 min(在冰上进行),形成均匀的乳浊液。
4. 冷冻离心机12000 rpm离心10min。
5. 小心地吸取上层水相至新管,用等体积饱和酚再抽提一次。
6. 用等体积的氯仿再抽提一次。
7. 离心后再取上清液于另一离心管中,加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L,并加2倍体积冷无水乙醇,上下倒置混匀,置-20℃冰箱沉淀30-60min。
8. 冷冻离心机12000 rpm离心10 min,弃上清液。
9. 加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。冷冻离心机6500 rpm离心5 min,弃上清,用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除,干燥10~15 min,不要等沉淀完全干燥,否则难以溶解。
10. 沉淀于100 μl超纯水中。
11. 将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。
Part II:SNP分型检测
1. 引物的设计与合成
(1) 查阅文献,参考文献中的引物,直接合成;
(2) 根据SNP的位置找到其序列,设计引物并合成
2. PCR扩增片段
(1) PCR扩增体系:
(2) PCR扩增程序:
(3) 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4) A. 测序法:对目的条带进行切胶回收纯化测序,根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。
B. 酶切法:一般这种方法都有文献支持,在前期可以确定好对应的内切酶。根据内切酶的反应体系将PCR产物进行酶切,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切条带来统计分析各个样本下该SNP的基因型。
Part II 标签SNP检测
1. 引物的设计与合成
根据基因的序列设计扩增片段引物并合成。
2. PCR扩增片段
(1) PCR扩增体系:
(2) PCR扩增程序:
(3) 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4) 将目的条带进行切胶回收纯化测序,将测序结果与NCBI库进行比对,找出各个样本目的基因突变的位置和形式,对结果进行汇总分析,计算某一种突变所占的百分比,根据结果找出关联性很强的几个突变位点,即为标签突变位点。
将这些突变位点与NCBI中SNP库进行比对分析,找出新发现的突变位点,可用于后续的验证和研究。