一、 TGE技术的核心优势

1.周期极短，效率极高：

快速产出：从基因克隆到获得毫克至克级的蛋白仅需2-4周，而建立稳定细胞株通常需要3-12个月。这极大地加速了药物靶点验证、候选药物筛选和毒理研究的进程。

操作简便：省去了繁琐的克隆筛选、单克隆化和稳定性评估等步骤，实验流程大大简化。

2.灵活性强，适用性广：

高通量筛选：非常适合在早期研发阶段对大量候选蛋白（如抗体、酶、疫苗抗原）进行快速表达和功能筛选。

表达毒性蛋白：对于在宿主细胞中组成性表达会产生毒性、导致细胞死亡的蛋白，TGE是理想的替代方案，因为蛋白表达是短暂的，细胞在死亡前已完成蛋白生产。

规模可调：可在从96孔板（微升级）到数百升生物反应器的不同规模下进行，满足从实验室研究到中试生产的需求。

3.成本效益（在早期阶段）：

虽然大规模生产时DNA和转染试剂成本较高，但在研发早期，它避免了建立稳定细胞株所需的高昂时间成本和人力投入，综合性价比极高。

4.正确的翻译后修饰：

与原核系统（如大肠杆菌）相比，哺乳动物细胞能进行复杂的翻译后修饰，如正确的糖基化、磷酸化、二硫键形成和蛋白折叠，确保生产的重组蛋白具有与天然蛋白相似的结构和生物活性。

二、 TGE技术的最新改进策略

尽管TGE优势明显，但其蛋白产量通常低于稳定表达系统，这是限制其大规模应用的主要瓶颈。近年来，通过对TGE系统的各个环节进行系统性优化，蛋白产量已从早期的mg/L级别提升至g/L级别（部分报道中HEK293系统可达1g/L，CHO系统可达2g/L以上）。主要改进策略如下：

1. 细胞系改造与工程化

这是提升TGE效率的根本策略之一，旨在提高细胞的转染效率、延长细胞寿命、增强蛋白合成与分泌能力。

抗凋亡改造：通过敲除促凋亡基因（如CHO细胞中的Bax和Bak）或过表达抗凋亡基因（如Bcl-xL），显著降低转染后的细胞凋亡率，延长蛋白生产周期。例如，过表达Bcl-xL的细胞系在培养14天后，融合蛋白产量可提高70-270%。

增强质粒维持：利用病毒元件维持质粒在细胞核内的游离状态和拷贝数。例如，将EB病毒核抗原-1（EBNA-1）与oriP序列，或SV40大T抗原与SV40 ori序列整合到细胞基因组中，可使质粒随细胞分裂而复制，显著延长表达时间并提高产量。携带EBNA-1的HEK293-6E细胞可将抗体产量提高10倍。

优化糖基化与代谢：通过基因编辑技术调整细胞的糖基化酶谱，使其产生更接近人源的糖型，或优化细胞代谢通路，为蛋白合成提供更充足的能量和前体物质。

各大公司已开发出专为TGE设计的高效细胞系，如赛默飞的Expi293F和ExpiCHO-S，这些细胞经过特殊驯化和改造，在悬浮培养、高密度生长和高效表达方面表现优异。

2. 表达载体工程

载体是基因表达的蓝图，其设计直接决定了蛋白的表达水平和质量。

启动子与增强子优化：

强启动子：除了常用的人巨细胞病毒（hCMV）即早期启动子，新型启动子如累麦基因开关启动子（CR5）被证明比CMV启动子的表达量高出3-4倍。

复合启动子：将不同启动子元件组合，如CMV与EF-1α启动子联用，可获得更高的转录活性。

调控元件：加入通用染色质开放元件（UCOE）、核基质附着区（MAR）等顺式作用元件，可有效防止转基因沉默，显著提升表达水平。

转录后调控元件：在载体中加入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）、内含子A等，可以提高mRNA的稳定性、核输出效率和翻译效率，使蛋白产量增加数倍甚至数十倍。

基因结构优化：

双启动子 vs. 双顺反子：对于需要同时表达重链和轻链的抗体，采用“双启动子”载体（HC和LC各有一个启动子）比“双顺反子”载体（用IRES连接）的表达效率更高，抗体滴度可提升1.4-1.9倍。

不同蛋白的最佳信号肽不同。通过筛选和优化信号肽（如来自人血清白蛋白或azurocidin的信号肽），可显著提升分泌型蛋白的分泌效率，产量最高可提升2.7倍。

3. 培养基与培养工艺优化

为细胞提供最佳的生长和生产环境是提高产量的关键。

无血清培养基（SFM）：使用成分明确的无血清培养基，消除了血清带来的批次差异、支原体污染风险和纯化困难，提高了工艺的一致性和安全性。

培养基添加剂：在基础培养基中添加蛋白胨（如小麦蛋白胨）、DMSO、醋酸锂（LiAc）等，可以改善细胞生长状态、提高细胞活力和蛋白产量。例如，添加蛋白胨可使IFN-γ产量增加60%。

过程控制：

温度调控：在转染后适当降低培养温度（如从37℃降至33℃），可以减缓细胞代谢、减少错误折叠蛋白的产生，从而提高蛋白质量和产量（可提升约1.5倍）。

高密度培养：采用波浪式生物反应器（WAVE Bioreactor）等系统进行高密度悬浮培养，细胞密度可达5×10⁶-1×10⁷ cells/mL，为大规模生产奠定基础。

光诱导表达：利用光激活CRISPR-dCas9效应器（LACE）系统，实现对基因表达的时空精确控制，进一步提高表达水平。

4. 辅助基因共表达

通过共表达一些辅助基因，可以改善细胞的生理状态，促进目的蛋白的正确折叠和分泌。

分子伴侣：共表达内质网伴侣蛋白或折叠酶（如XBP-1S），可以增强内质网的蛋白加工能力，减少蛋白聚集，提高分泌效率。共表达XBP-1S可使治疗性蛋白效价提高15-85%。

抗凋亡/促生长基因：共表达miR-17等microRNA可以促进细胞生长，提高重组蛋白产量。

增强质粒复制：共表达NDPK-A（核苷二磷酸激酶A）和EBNA-1，可协同作用显著提高TGE水平。

5. 转染技术与试剂的优化

转染试剂：聚乙烯亚胺（PEI）因其价格低廉、操作简便和高效率，成为TGE的首选转染试剂。最新的改进包括使用去酰化的PEI "Max"或PEIpro™等高效配方，以及优化DNA与PEI的质量比（通常在1:2到1:3之间）和细胞密度。

新型转染系统：对于难转染的细胞，杆状病毒载体系统（BacMam）展现出巨大潜力。它能高效将基因导入多种哺乳动物细胞，并支持多基因同时表达，特别适用于生产复杂的蛋白复合物或病毒样颗粒（VLP）。