一、 核心概念定义：LOB, LOD, LOQ

在验证之前，必须清晰理解三个核心概念，它们是评估检测能力的基石：

1.空白限度 (Limit of Blank, LOB)：在不含分析物的样本中，通过重复测试所能获得的最高表观浓度。它代表了方法的背景噪音水平。

2.检测限度 (Limit of Detection, LOD)：能够与LOB可靠区分的最低分析物浓度。在此浓度下，我们只能定性判断“有”或“无”，但不能进行精确的定量。根据CLSI EP17指南，含LOD浓度的样本应在95%的情况下能与LOB区分开。

3.定量限度 (Limit of Quantitation, LOQ)：不仅能被检测到，还能达到预设的精密度和准确度要求的最低浓度。这是方法可以进行可靠定量的起点。根据定义，LOQ必须等于或大于LOD。

 

二、 确定LOD和LOQ的常用方法

验证方法的选择取决于开发阶段（早期研发 vs. 最终验证）和适用法规。

方法1：基于标准曲线的统计计算法（最常用、最严谨）

这是方法验证阶段，尤其是最终验证时推荐的方法，因为它不依赖于单次实验的信噪比，而是基于统计分析。

原理：通过分析空白样本和低浓度样本的响应值波动性，结合标准曲线的灵敏度来计算。

计算公式：

LOD = 3.3 × δ / S

LOQ = 10 × δ / S

δ (Delta)：响应值的标准偏差。可以通过以下方式获得：

对至少10-20份独立的空白样本进行测试，计算其响应值的标准偏差。

使用标准曲线的剩余标准偏差（Standard Error of the Estimate）。

使用标准曲线截距的标准偏差。

S：标准曲线在低浓度范围内的斜率，代表方法的灵敏度。

优点：统计学意义明确，结果稳健，是ICH Q2(R2)和CLSI EP17指南推荐的核心方法。

缺点：需要较多的样本和重复测试。

方法2：信噪比法 (S/N法)

这种方法直观、快速，常用于早期开发阶段或仪器性能确认，但在最终方法验证中需谨慎使用。

原理：通过比较低浓度样本的信号（Signal）与基线噪音（Noise）的比值来确定。

LOD：通常定义为信噪比（S/N）≥ 3:1 时的浓度。

LOQ：通常定义为信噪比（S/N）≥ 10:1 时的浓度。

Simoa中的应用：在Simoa中，“信号”是阳性微孔的计数，“噪音”可以是空白样本的阳性孔计数或背景荧光。

重要提醒：信噪比受仪器状态、试剂批次、操作人员等影响巨大。它反映的是“系统检出限”，而非“方法检出限”。因此，在最终验证中，不能仅凭S/N=3/10就下结论，必须结合精密度和准确度进行确认。

方法3：基于精密度和准确度的实验确定法（ICH Q2(R2)推荐）

这是目前法规最推崇的方法，它将LOQ从一个“计算值”变成一个“验证值”。

原理：选择一个预期的低浓度（例如，基于报告限的1/10或1/5），通过实验证明在该浓度下，方法的精密度和准确度满足要求。

验证步骤：

设定目标浓度：选择一个特定的低浓度点，如0.5 pg/mL。

进行验证实验：在该浓度下，进行至少6次独立的、涵盖不同批次、不同操作员、不同日期的重复测试。

评估结果：

精密度：浓度的变异系数（CV%）应≤20%（在LOQ处可放宽至25%）。

准确度：测得浓度的均值应在标示值的±20%范围内（在LOQ处可放宽至±25%）。

结论：如果上述标准得到满足，则该浓度可被正式确定为LOQ。

优点：最能反映方法在实际应用中的真实性能，直接关联到方法的可靠性。

方法4：直观法

原理：通过目视观察或简单的统计分析，确定能被可靠检测或定量的最低浓度。例如，对一系列浓度递减的样本进行测试，找出能100%检出的最低浓度为LOD，能100%定量且误差可接受的最低浓度为LOQ。

应用：适用于非仪器方法或在开发初期进行快速估算。

 

三、 Simoa技术特有的验证考量

由于Simoa是基于单分子计数的数字免疫分析，其验证有一些特殊之处：

1.空白信号（AEB）的控制：Simoa的背景信号通常用“每珠平均酶数”（Average Enzyme per Bead, AEB）来衡量。在Homebrew开发中，通常建议将空白AEB控制在0.005-0.05之间。一个极低且稳定的空白信号是实现低LOD的前提。

2.泊松分布校正：Simoa的定量基于泊松分布，计算阳性孔的比例。在极低浓度下，这种统计效应尤为重要，因此标准曲线的拟合（通常是4参数逻辑回归，4PL）和数据分析算法对LOD/LOQ的确定有直接影响。Quanterix提供的4PL方法开发工具就利用了这一原理，通过CV分析来估算LOQ。

3.关键实验变量：在设计验证实验时，必须考虑以下变量以确保结果的普适性：

4.试剂盒批次：至少2-3个批次。

5.操作员：如果使用半自动仪器（如SR-X），需包含不同操作员。

6.天数：至少2-3天，以评估批间变异。

7.样本类型：使用与实际检测样本一致的基质（如人血清、血浆、CSF）。

8.重复次数：根据CLSI EP17，空白和低浓度样本的总重复次数通常建议≥60次（例如，2个批次 x 3天 x 10次重复）。

 

四、 总结与实践建议

验证阶段	推荐方法	核心目标	注意事项
早期开发/筛选	信噪比法 (S/N)、直观法、标准曲线插值	快速估算，比较不同抗体对/条件的性能	结果仅供参考，不能作为最终报告依据。
方法开发/优化	基于响应值标准偏差和斜率法	科学计算LOD/LOQ，指导实验条件优化	需保证空白和低浓度样本的重复次数足够。
最终方法验证	基于精密度和准确度的实验确定法 (首选) + 统计计算法 (辅助)	提供法规认可的、可靠的LOQ	必须使用真实样本，在预期使用条件下进行多批次、多天、多操作员验证。LOQ的CV%和准确度是核心指标。

一句话总结：对于Simoa这类超灵敏技术，不能盲目迷信信噪比。最权威的LOQ验证是在预期的定量下限浓度附近，通过严谨的多批次、多天重复实验，证明其精密度（CV%）和准确度（回收率）符合预设标准（如CV≤20%）。LOD则可以通过统计方法（3.3δ/S）或与LOB区分的实验来确定，作为方法检出能力的参考。