一、培养条件

1.培养基：89% H-DMEM + 10% FBS + 1% 双抗（青霉素-链霉素）。

2.气相环境：95% 空气 + 5% CO₂。

3.温度：37℃，培养箱湿度维持70%-80%。

 

二、细胞接收与检查

1.开箱检查：

核对培养瓶标注的细胞名称与订购信息是否一致。

检查培养瓶是否破损、漏液或培养基浑浊。

2.显微镜观察：

若无异常，用40x、100x、200x倍数拍照保存（前三天照片为售后依据）。

若发现污染或细胞死亡，立即联系供应商并提供照片。

 

三、细胞传代

1.传代时机：细胞密度达80%-90%时传代。

2.操作步骤：

弃上清：吸除培养瓶内旧培养基。

PBS润洗：用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，去除残留血清。

3.消化细胞：

加入1-2ml 0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化液，37℃培养箱消化1-2分钟。

显微镜下观察，细胞回缩变圆、透亮且轻拍瓶壁呈流沙样脱落时，立即终止消化。

终止消化：加入5ml完全培养基（含10% FBS），轻柔吹打细胞至单细胞悬液。

离心：将悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。

4.重悬与分瓶：

用1-2ml完全培养基重悬细胞，按1:2比例分至新T25培养瓶。

每瓶补充完全培养基至5-8ml，放入37℃、5% CO₂培养箱培养。

5.注意事项：

消化时间需严格控制，避免过度消化导致细胞死亡。

传代比例可根据细胞生长速度调整（生长慢的细胞可按1:2传代）。

 

四、细胞冻存

1.冻存时机：细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时冻存。

2.操作步骤：

弃上清：吸除培养瓶内旧培养基。

PBS润洗：用PBS清洗细胞一次。

3.消化细胞：

加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化至细胞回缩变圆。

加入5ml完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞至单细胞悬液。

离心：将悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。

4.冻存液配制：

方案一：92%完全培养基 + 8% DMSO（现用现配）。

方案二：90% FBS + 10% DMSO（适用于对DMSO敏感的细胞）。

5.冻存管分装：

用1ml冻存液重悬细胞，转移至冻存管。

标记冻存管（细胞名称、冻存日期、操作者信息）。

6.程序降温：

将冻存管置于-20℃ 1.5小时，再转移至-80℃过夜。

24小时后转入液氮罐长期保存。

7.注意事项：

冻存液需预冷至4℃再使用，减少细胞损伤。

冻存管需做好标识，避免混淆。

 

五、细胞复苏

1.操作步骤：

水浴解冻：从液氮罐中取出冻存管，迅速置入37℃水浴中摇晃解冻，直至无结晶。

酒精消毒：用75%酒精擦拭冻存管外壁。

2.离心去DMSO：

将细胞悬液转移至含5ml完全培养基的15ml离心管，1000rpm离心5分钟。

弃上清，用5ml完全培养基重悬细胞。

接种培养：将细胞悬液接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO₂培养箱培养。

换液：次日更换新鲜完全培养基，去除残留DMSO。

3.注意事项：

复苏过程需快速，避免细胞反复冻融。

复苏后细胞需静置培养24小时再观察状态。

 

六、常见问题与解决

1.细胞生长缓慢：

检查培养基是否过期或血清质量。

适当提高血清浓度（最高不超过20%）。

确认培养箱温度、CO₂浓度是否正常。

2.细胞贴壁不牢：

运输过程中细胞脱落属正常现象，可离心重悬后接种至新瓶。

检查培养瓶表面是否处理得当（如未使用包被剂）。

3.细胞污染：

发现污染后立即丢弃细胞，并对培养箱、超净台消毒。

联系供应商提供售后支持（需提供污染照片及实验记录）。

4.细胞死亡：

检查冻存、复苏过程是否规范（如冻存液配制、降温速度）。

确认细胞是否因运输时间过长导致损伤。