一、染色原理

NADH心肌黄酶（NADH-TR）是线粒体中的关键酶，参与细胞呼吸链的电子传递过程。其活性染色基于以下化学反应：

1.酶促反应：NADH-TR催化氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）还原为还原型FADH₂，同时传递氢原子给氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺），形成还原型NADH。

2.显色反应：NADH作为电子供体，还原人工电子受体（如硝基蓝四氮唑NBT或二甲基噻唑二苯基四唑溴盐MTT），生成不溶性甲臜色素（蓝紫色沉淀）。

3.结果观察：酶活性高的区域（如富含线粒体的细胞）因甲臜色素沉积呈现蓝紫色，而酶活性低或无的区域则无色或颜色较浅。

二、染色步骤（以标准流程为例）

1.试剂准备：

**清理液（Reagent A）用于清洗切片，去除杂质。

染色液（Reagent B）：含NBT或MTT等染料，需避光保存于-20℃。

反应液（Reagent C）：含NAD⁺等底物，需避免反复冻融。

固着液（Reagent D）：用于固定染色结果，通常为中性甲醛或甘油明胶。

2.切片处理：

切片制备：使用冷冻切片机将组织切成10-20微米厚的薄片，贴附于载玻片上。

固定：根据组织类型选择合适的固定液（如丙酮、戊二醛）进行短暂固定，以保持酶活性。

清洗：用清理液清洗切片，去除固定液残留。

3.染色与孵育：

配制染色工作液：按比例混合染色液和反应液（如900微升染色液+100微升反应液），混匀后置于冰槽中避光备用。

染色：在切片上滴加染色工作液，铺满样品表面，放入37℃培养箱中孵育30-60分钟（时间可根据酶活性强弱调整），避免光照。

清洗：孵育结束后，用清理液清洗切片，去除未反应的染色工作液。

4.固定与封片：

固定：在切片上滴加固着液，室温孵育15分钟以固定染色结果。

清洗：再次用清理液清洗切片，去除固着液残留。

封片：用中性树脂封片，避免气泡产生，即可在光学显微镜下观察。

三、应用领域

1.肌肉组织分型：

慢速收缩型肌纤维（Ⅰ型）：NADH-TR染色深，线粒体丰富，主要进行氧化代谢。

快速收缩型肌纤维（Ⅱ型）：NADH-TR染色浅或无色，线粒体较少，主要进行糖酵解代谢。

2.代谢特性研究：

通过比较不同组织或细胞中NADH-TR的活性，可以揭示其代谢途径和能量产生方式。

在疾病研究中，NADH-TR活性的变化可能反映组织代谢状态的改变，为疾病诊断和治疗提供依据。

3.病理诊断：

NADH-TR活性染色可用于鉴别某些肌肉疾病（如肌营养不良症、线粒体肌病等）中肌纤维的代谢异常。

通过观察染色结果的分布和强度，可以评估肌肉组织的损伤程度和修复能力。

四、注意事项

1.避光操作：染色液和反应液对光敏感，需避光保存和使用，以免影响染色效果。

2.温度控制：孵育温度需严格控制在37℃，以确保酶促反应的顺利进行。温度过高或过低均可能影响酶活性，导致染色结果不准确。

3.试剂保存：染色液和反应液需按说明书要求保存，避免反复冻融或长时间暴露于高温环境中。

4.切片处理：切片制备过程中需保持组织结构的完整性，避免过度拉伸或压缩导致染色结果失真。

5.对照实验：设置阴性对照（染色工作液中不含有反应液）和阳性对照（如心肌组织）以验证染色结果的可靠性。