HRM技术（高分辨率熔解曲线分析）是一种高通量、低成本的SNP、突变和甲基化检测方法，其核心原理是通过实时监测PCR产物熔解过程中荧光染料信号的变化，结合高分辨率温度检测和饱和荧光染料，实现单碱基差异的精准区分。

一、技术原理与优势

1.高分辨率与灵敏度

HRM技术通过每升高1℃采集25次荧光数据（常规方法仅4-5次），结合0.02-0.1℃的升温精度，可区分Tm值差异极小的样本（如单碱基突变或甲基化差异）。

检测限低至0.1%：在肿瘤研究中，可检测1000个正常细胞中1个突变细胞，灵敏度远高于“PCR+测序”法（需25%突变率）。

2.闭管操作与成本效益

PCR扩增与熔解分析在同一管内完成，避免交叉污染，减少后续处理步骤。

检测费用仅为测序或TaqMan探针法的1/10-1/5，适合大样本量筛查。

3.高通量与灵活性

支持10-384样本同步检测，适用于多SNP、多突变位点及多位点甲基化扫描。

不受突变类型或位点限制：可检测已知/未知突变、SNP、插入/缺失及甲基化状态。

 

二、在SNP与突变检测中的应用

1.SNP分型

原理：不同SNP位点的GC含量及分布差异导致熔解曲线形状独特，形成“DNA指纹图谱”。

优势：无需序列特异性探针，1次反应即可完成分型，特异性达100%，准确性优于TaqMan探针法（需针对特定位点设计探针）。

案例：

快速筛查线粒体DNA超变区（HVI/HVII）的SNP，用于法医学个体识别，节省测序时间与费用。

在遗传病研究中，检测LMNA基因突变（导致核纤层蛋白综合征），灵敏度与特异性均达100%。

2.突变扫描

原理：突变导致DNA双链稳定性改变，熔解温度（Tm）偏移，形成特征性曲线。

优势：

可检测点突变、缺失、重复等所有类型突变。

对400bp以下片段检测灵敏度达100%，400-1000bp片段灵敏度96.1%、特异性99.4%。

案例：

筛查EGFR基因突变，指导肺癌靶向治疗药物选择。

检测登革病毒，灵敏度达1.0×10²拷贝/mL。

 

三、在甲基化检测中的应用

1.原理

重亚硫酸盐处理DNA后，未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化C保持不变。

甲基化DNA的GC含量更高，Tm值升高，熔解曲线右移；杂合甲基化样本呈现双峰或肩峰。

2.优势

高通量：单次检测可覆盖多个CpG位点，适合全基因组甲基化筛查预实验。

高灵敏度：可检测低至0.1%的甲基化水平，如MGMT启动子区域甲基化检测。

低成本：无需甲基化特异性探针或芯片，费用仅为测序法的1/20。

3.临床应用

肿瘤早期诊断：检测抑癌基因（如BRCA1、p16）启动子甲基化，辅助肿瘤分型与预后评估。

化疗敏感性预测：MGMT启动子甲基化状态可预测胶质瘤患者对烷化剂化疗的响应。

 

四、技术局限性与解决方案

1.扩增子长度限制

问题：扩增子>400bp时灵敏度下降（96.1%）。

解决方案：设计短片段引物（100-150bp），优化PCR条件（如使用热启动DNA聚合酶）。

2.仪器要求高

问题：需高分辨率熔解仪器（如Rotor-Gene Q、LightCycler 480），常规定量PCR仪孔间温差大（0.3-0.5℃），影响结果准确性。

解决方案：选择具备空气加热或样品温度单独控制功能的仪器，确保温度均一性（Tm标准偏差<0.1℃）。

3.数据复杂性

问题：熔解曲线形状受GC含量、序列长度等多因素影响，需专业软件分析。

解决方案：结合非标记探针或机器学习算法，提高数据解读自动化程度。

 

五、与其他技术的对比

技术	HRM	测序	TaqMan探针法	芯片
通量	高（384样本/次）	低（需逐个测序）	中（依赖探针数量）	高（全基因组）
灵敏度	0.1%	20-25%	1%	5-10%
特异性	100%	100%	95-98%	90-95%
成本	低（$0.1-0.5/样本）	高（$5-10/样本）	中（$1-2/样本）	高（$2-5/样本）
操作复杂度	简单（闭管）	复杂（需纯化、测序）	简单（需探针设计）	中等（需杂交、洗涤）
应用场景	SNP筛查、突变扫描、甲基化	金标准（未知突变验证）	已知SNP分型	全基因组关联分析