MS-HRM技术（甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析）是一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）的甲基化检测方法，具有操作简便、灵敏度高、成本低等优势，在遗传学、肿瘤学等领域展现出重要应用价值。以下从技术原理、优势、应用场景及局限性四个方面展开介绍：
一、技术原理
1.DNA处理：
使用重亚硫酸盐处理DNA样本，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变。
2.PCR扩增：
设计针对处理后DNA的引物，扩增包含目标CpG岛的片段。甲基化状态差异会导致扩增产物中GC含量不同。
3.熔解曲线分析：
利用高分辨率熔解曲线仪，通过荧光染料（如LC Green、SYTO9）结合双链DNA，监测温度升高时DNA双链解链的荧光信号变化。
甲基化DNA：GC含量高，熔解温度（Tm）较高，熔解峰偏右。
未甲基化DNA：GC含量低，Tm较低，熔解峰偏左。
杂合甲基化：同时存在甲基化和未甲基化位点，熔解峰呈现双峰或肩峰。
二、技术优势
1.操作简便：
无需序列特异性探针或后续处理（如测序、电泳），闭管操作减少交叉污染。
引物设计灵活，可同时检测已知或未知突变、SNP及甲基化位点。
2.灵敏度高：
可检测低至0.1%-0.01%的甲基化水平，SNP检测灵敏度和特异性均达100%。
3.高通量：
单次检测最多384个样本，60-90分钟内完成，适合大样本量分析。
4.成本低：
试剂消耗少，无需昂贵设备（如测序仪），费用远低于测序或TaqMan探针法。
5.重复性好：
熔解曲线形状稳定，结果可靠，适合临床验证。
三、应用场景
1.肿瘤标志物检测：
检测抑癌基因（如BRCA1、p16）、凋亡相关基因（如DAPK1）或DNA修复基因（如MGMT）启动子甲基化，辅助肿瘤早期诊断和预后评估。
示例：MGMT启动子甲基化可预测胶质瘤患者对烷化剂化疗的敏感性。
2.遗传病研究：
分析基因突变（如SNP）与甲基化的关联，揭示表观遗传调控机制。
药物疗效评价：
通过监测特定基因甲基化状态变化，指导化疗药物选择和剂量调整。
3.高通量验证：
作为基因芯片筛选后的验证工具，在更多样本中确认甲基化位点。
四、局限性
1.检测位点限制：
适合检测位点较少（如单个CpG岛）的样本，全基因组甲基化分析需结合其他技术（如甲基化芯片或测序）。
2.仪器要求：
需配备HRM模块的实时荧光定量PCR仪（如Rotor-Gene Q、LightCycler 480），部分实验室可能不具备。
3.引物设计挑战：
引物需覆盖目标CpG岛，且避免非特异性扩增，设计难度较高。
五、总结
MS-HRM技术以“简、效、快、廉”为核心优势，成为甲基化检测领域的重要工具，尤其在肿瘤标志物筛查和临床用药指导中表现突出。然而，其局限性需结合研究目的选择合适方法（如全基因组甲基化分析需采用甲基化芯片或测序技术）。
随着实时荧光定量PCR仪的普及，MS-HRM有望在更多实验室和临床场景中推广应用。
