一、核心测定方法

1.表面等离子体共振（SPR）技术

原理：通过芯片表面固定靶点蛋白（如VEGF），实时监测双抗分子与靶点的结合与解离过程，生成结合动力学曲线。

应用案例：罗氏制药开发的Faricimab（全球首款眼科双抗）采用Biacore系统，通过CM5芯片偶联VEGF蛋白，捕获不同浓度双抗后，注入Ang-2抗原，分析R1（VEGF结合活性）和R2（双抗数量及活性）信号变化。实验显示，R2信号随双抗浓度增加呈S曲线，浓度高于10 μg/mL时信号负增长，表明SPR可精准确定最佳进样浓度。

优势：无需标记样本、实时在线测量、减少实验变量，线性相关性R²=0.9997，准确性达97%，偏差仅2%。

2.双抗夹心ELISA法

原理：利用两种特异性单克隆抗体分别捕获和检测双抗分子，形成“夹心”结构，通过酶标仪读取信号强度。

应用案例：

狂犬病疫苗效价检测：以单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法检测狂犬病毒糖蛋白G含量，与NIH法（传统动物实验）结果呈正相关（lgED50范围2.60-2.78 vs 2.55-2.85），且具有重复性好、成本低、快速等优势。

乙型脑炎疫苗效价检测：双抗夹心ELISA法测得的中和指数与蚀斑减少中和试验法结果无统计学差异（t=0.0793, P>0.05），灵敏度差异显著（F=56.25, P<0.01），但成本更低、操作更简便。

优势：适用于大规模筛查，可间接反映双抗分子活性。

3.细胞桥接实验

原理：模拟双抗分子在体内的作用机制，通过桥接靶细胞和效应细胞（如T细胞），检测细胞杀伤或激活效应。

应用案例：T细胞双抗（如anti-CD3×anti-TAA）通过形成免疫突触激活T细胞，释放穿孔素和颗粒酶B裂解靶细胞。结合实验（ELISA/SPR）与细胞杀伤实验联合使用，可全面评估双抗分子的生物活性。

优势：直接反映双抗分子的功能活性，适用于临床阶段生物测定。

二、关键技术参数与优化

1.浓度依赖性分析

通过SPR技术确定双抗分子的最佳进样浓度。例如，Faricimab实验中，当进样浓度高于10 μg/mL时，R2信号呈负增长，表明高浓度可能导致芯片表面位点饱和或非特异性结合。

2.特异性验证

使用单型亲本抗体或同型对照进行测试。Faricimab实验中，单型亲本抗体或同型对照无信号响应，而处理后的抗体活性降低，证明效价测定方案具有强特异性。

3.数据分析模型

采用slope-ratio、parallel-ratio、parallel line model等模型分析数据。例如，Faricimab实验中，通过不同模型验证线性相关性（R²=0.9997）、准确性（97%）和偏差（2%）。

三、不同开发阶段的应用策略

1.早期开发阶段

结合实验：使用ELISA或SPR技术评估双抗分子与靶点的结合能力，筛选高亲和力克隆。

案例：在双抗细胞株开发中，利用Protein A芯片进行滴度测定，结合三明治法评估克隆表达水平及纯度，筛选出高产且组成正确的双抗克隆。

2.临床前阶段

生物活性测定：开发基于细胞桥接实验的生物测定方法，监测双抗分子诱导细胞杀伤或激活的效应。

案例：T细胞双抗通过报告基因法检测效应细胞激活，结合细胞杀伤实验评估靶细胞杀伤效果。

3.临床阶段

复杂生物测定：开发能够反映双抗分子作用机制（MoA）的生物测定方法，如凝血酶生成分析（归巢双抗）或荧光示踪检测（体内分布）。

案例：归巢双抗通过荧光示踪检测其在体内和细胞内的分布，评估靶向递送效率。

四、挑战与未来方向

1.技术挑战

双靶点活性平衡：需同时优化双抗分子对两个靶点的结合亲和力，避免单一靶点过度结合导致活性失衡。

标准化与监管审批：缺乏统一的图像分析流程和设备性能参数标准，需通过监管审批以推动临床转化。

成本与可及性：高端设备（如Biacore）价格较高，基层医院普及率有限。

2.未来趋势

多模态融合：结合MRI、超声等技术，实现结构-功能-分子信息的同步获取。

人工智能辅助：利用深度学习算法优化图像重建与分析，提升诊断效率与准确性。

微型化与便携化：开发手持式设备，拓展至基层医疗与床旁诊断。