一、实验设计与样本准备

1.样本类型与数量：

样本类型多样，包括组织类细胞、免疫细胞、血液细胞、癌组织细胞、神经类细胞等。

样本数量需根据实验目的确定，一般建议每组保证一定的生物学重复，如人的样本每组尽量保证5个样本的生物学重复，动物模型的样本每组尽量保证3个生物学重复。

2.细胞悬液制备：

细胞悬液需进行质检和计数，一般要求细胞数目≥5万，细胞存活率≥80%（建议>90%），细胞浓度为700~1200 cells/μL。

细胞直径≤40μm，过大需制备细胞核悬液。

细胞悬液中的碎片和结团会影响实验结果，需尽量去除。

3.样本保存与运输：

新鲜样本能最大程度地提高样本质量，但有些样本可能需要进行保存以方便运输或储存。

细胞悬液的冷冻保存是长期储存和运输的常用方法，但采集样本的过程中可能无法进行冷冻保存或组织解离，此时可使用组织保存液，在4℃条件下储存。

二、实验操作与测序

1.建库方式：

10x单细胞转录组建库有5’端和3’端建库两种方式。3’端建库中，Gel beads的末端序列是poly(dT)，用于和转录组3’端的polyA结构互补配对；5’端建库中，Gel beads的末端序列是TSO序列，其末端有polyG的结构。

2.测序深度与数据量：

测序深度是指对每个细胞的转录组进行的测序覆盖度，适当增加测序深度可能有助于提高数据量和对低丰度转录物的检测能力。

数据量较少可能由多种因素导致，如细胞中的mRNA数量有限、低丰度转录物在实验过程中丢失、扩增偏差、实验操作失误或试剂质量问题、细胞活性低或损伤等。

3.多细胞率与上机细胞数：

多细胞率与上机的细胞数有关，一般而言，上机的细胞数量越多，多胞率也越高。但多胞率不仅与上机细胞数量有关，还与仪器平台、悬液质量等因素有关。

三、数据分析与结果解读

1.降维方法：

单细胞测序数据结果往往比较庞大，其表达矩阵是高维数据。为了可视化结果及后续的聚类分析，会对数据进行降维处理。常见的降维方法有PCA（主成分分析）、t-SNE（t-分布随机邻近嵌入）、UMAP（统一多尺度嵌入）等。

2.聚类结果：

从单个细胞数据得到的聚类结果并非始终一致，这主要由实验操作的差异（如样本处理、测序深度等）、预处理策略、特征基因选择、降维方法、聚类算法和参数设置等因素决定。

3.细胞类型鉴定：

寻找细胞亚群的marker基因即对细胞类型进行鉴定。一般常规细胞群体的鉴定是参考公共marker基因数据库，如cellmarker数据库、HCA数据库、cancersea数据库等。对于一些非常见的细胞类型的鉴定，需要从相关文献收集相应的marker基因进行鉴定。

四、其他常见问题

1.单细胞转录组与bulk转录组的区别：

在传统的bulk转录组测序技术中，上机测序的样本是由多个细胞构成的，分析得出的结论是基于所有细胞的平均水平。而单细胞转录组测序能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态。

2.细胞悬液制备过程中是否会影响基因的表达：

常用的细胞悬液制备方法中，不管是酶消化还是机械操作都会不可避免地对细胞产生影响。前者会使细胞产生应激反应，后者则容易损伤细胞，进而影响细胞活性。因此，在单细胞测序实验设计时，设置对照是非常重要的。