密度梯度离心法分离PBMC原理及实验步骤

一、原理

密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的原理基于不同细胞类型的密度差异。红细胞和粒细胞的密度较大（约1.092 g/mL），而淋巴细胞和单核细胞的密度较小（约1.075 g/mL）。通过使用密度介于1.077 g/mL左右的Ficoll分离液，在离心过程中，不同密度的细胞会分层：

1.红细胞和粒细胞：密度较大，离心后沉于管底。

2.PBMC（淋巴细胞和单核细胞）：密度小于或等于Ficoll分离液，离心后漂浮于分层液的液面上，形成白色云雾层。

3.血浆和血小板：密度最小，悬浮于分层液的上部。

通过吸取分层液液面上的白色云雾层，即可分离得到PBMC。

 

二、实验步骤

1.材料与试剂准备

试剂：

抗凝处理的外周血样本（如肝素钠或EDTA抗凝）。

密度梯度分离液（如Ficoll-Paque，密度1.077 g/mL）。

无菌PBS缓冲液（可添加0.1% BSA或5% FBS，防止细胞聚集）。

红细胞裂解液（如需去除残留红细胞）。

器材：

15 mL或50 mL无菌离心管。

移液枪、吸管。

水平离心机。

显微镜（用于细胞计数）。

2.样本预处理

将采集的抗凝全血用等体积的PBS或生理盐水稀释，轻轻混匀。例如，5 mL血液加5 mL PBS。

3.制备梯度界面

取一个无菌离心管，加入适量的Ficoll分离液（如5 mL）。

用吸管或移液枪将稀释后的血液沿着离心管管壁缓慢铺在Ficoll分离液上方，保持界面清晰，避免混合。血液与Ficoll的体积比通常为1:1。

4.密度梯度离心

设置离心参数：

转速：400×g（约1500-2000 rpm，具体根据离心机型号调整）。

温度：室温（18-25℃）。

时间：20-30分钟。

离心过程中关闭刹车功能（将减速设为0），防止离心结束时的震动破坏细胞分层。

离心结束后，离心管内会出现明显的分层现象：

最上层：血浆和血小板（透明或淡黄色）。

中层：Ficoll分离液。

白膜层：PBMC（位于血浆与Ficoll分离液界面处）。

最底层：红细胞和粒细胞（红色压实层）。

5.收集PBMC

用吸管或移液枪小心吸取白膜层的PBMC，转移到新的无菌离心管中。避免吸入上层的血浆或下层的Ficoll分离液。

6.洗涤细胞

向装有PBMC的离心管中加入5-10 mL PBS或培养液，轻柔混合均匀。

离心：150-200×g，5-10分钟。

弃去上清液，重复洗涤1-2次，以去除残留的Ficoll分离液。

7.细胞重悬与计数

洗涤完成后，用适量的培养基或PBS重悬PBMC。

为检测细胞活力，可采用台盼蓝染色法：活细胞不会被染色，死细胞会被染成蓝色。

使用细胞计数板对细胞进行计数，并根据实验需求将细胞浓度调整到合适水平（如1×10⁶ cells/mL）。

 

三、注意事项

1.样本处理：

采血后应尽快进行实验操作，防止血液凝固。

稀释血液时需轻柔混合，避免细胞损伤。

2.离心条件：

离心过程中需保持界面清晰，避免血液与Ficoll分离液混合。

离心速度和时间需严格按照设定参数操作，避免分层不清晰。

3.细胞收集：

吸取PBMC时需小心，避免吸入上层血浆或下层Ficoll分离液。

洗涤细胞时转速不宜过高（控制在200×g以下），以免损伤细胞。

4.细胞保存：

若分离的PBMC需用于细胞培养或体内实验，整个操作必须在生物安全柜中进行，所使用的试剂和器材需提前灭菌处理。

 

四、常见问题及解决方法

1.分层不清晰：

可能原因：铺样时血液与Ficoll分离液混合，或离心速度、时间不足。

解决方法：重新进行实验操作，注意保持界面清晰，严格按照离心参数操作。

2.细胞活力较低：

可能原因：洗涤不彻底导致Ficoll分离液残留，或离心速度过高、温度不适宜。

解决方法：优化洗涤步骤和离心条件，确保细胞活力。