一、磷酸化蛋白WB怎么跑？

 Western Blot是一种关键的实验方法，用于检测蛋白质的磷酸化状态。与检测非磷酸化蛋白相比，其操作并无太大差异。然而，磷酸化蛋白通常只占细胞总蛋白的一小部分，且容易在实验处理过程中失去磷酸化修饰。

导致Western Blot检测磷酸化蛋白失败的原因有很多，例如可能出现封闭问题、抗体选择问题，或待检测的磷酸化蛋白可能在样本中不存在或含量低于检测的灵敏度。

此篇文章总结了以下操作要点，供从事磷酸化蛋白实验的人们参考。

二、确定样本中磷酸化蛋白的表达量

不同蛋白刺激条件各不相同,可根据需要文献和预实验来确定,也可以利用PhosphoSitePlus数据库查询蛋白的磷酸化情况。

三、WB实验中检测磷酸化蛋白时，需要注意以下几点：

1.样本处理

在裂解过程中，为避免或减少蛋白酶和磷酸酶的释放对检测结果的影响。为确保操作样本速度快，需将样本置于冰上操作，并使用预冷的缓冲液。同时，应在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则可能导致Western blot条带过浅或无条带现象。另外，样品中或在其他试剂中可能存在细菌，它们也可能分泌外源性的磷酸酶，故应尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶。
2.样本上量    
磷酸化蛋白通常存在较低的丰度，仅约为总蛋白量的10%。这种特性可能会导致在进行 Western Blot 实验时检测到的信号较弱。为了获得清晰的磷酸化条带，可以考虑增加每个样品上加载的蛋白量。
3.检测总蛋白含量:

为了确定Western Blot上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要对总蛋白含量进行检测。只有磷酸化蛋白与总蛋白的比值发生变化，才能表明磷酸化水平出现变化。在一般情况下，磷酸化蛋白和总蛋白在Western Blot上的条带位置基本相同，因此在完成磷酸化抗体处理后，可以进行膜脱除步骤，随后再进行总蛋白抗体的孵育操作。此步骤有助于确保准确检测磷酸化水平的变化情况。

Stripping Buffer配方:取0.76g Tris碱,2g SDS和700μl β-巯基乙醇,加蒸馏水至100ml。用盐酸调整pH到6.8。

4.抗体选择:

磷酸化的检测质量取决于所选择的磷酸化抗体。为了确保实验的准确性和可靠性，在进行Western Blot实验时应当选择具有高度特异性的磷酸化蛋白抗体，并根据高质量的文献引用进行选择。在实验过程中，还需要根据实际情况适当调整抗体的稀释倍数，以保证最佳的检测效果。通过这些步骤的严谨执行，可以确保Western Blot实验结果的可靠性和科学性。

5.优化封闭条件:

在进行Western Blot实验时，建议在4℃条件下将抗体与膜上的蛋白孵育过夜。为了确保最佳效果，建议使用实验级脱脂牛奶作为抗体的稀释液，而非实验级奶粉，因为后者可能含有磷酸酶等杂质，这些杂质可能会干扰磷酸化抗体与目标蛋白的结合。为了避免这种情况发生，可以考虑使用牛血清白蛋白（BSA）或不含蛋白的封闭剂。此外，在实验过程中应注意避免膜封闭时间过长、洗涤时间过长以及洗涤时摇床转速过快。

6.检测条件优化:

选择合适的底物进行化学发光检测,在优化实验条件时，可以尝试调整底物的浓度、孵育时间和温度，以确保获得清晰且准确的检测结果。特别是在孵育时间的控制上，建议根据实验需要进行细致调整，避免过长或过短的孵育时间影响实验结果的准确性。

7.结果分析:

磷酸化蛋白的检测中出现非特异性的条带现象。针对这种情况，研究人员通常需要依靠与对照组的比较来进行进一步的分析和判断。在分析过程中，特别需要注意区分和识别出特异性与非特异性条带，这对于准确解读实验结果至关重要。除了对照组的比较外，还可以考虑增加合适的阴性对照和阳性对照来验证实验结果的可靠性，从而确保实验数据的准确性和可靠性。

8.内参的问题:

在磷酸化蛋白检测实验中，通常需要同时设置两个内参来确保实验结果的准确性。首先是与磷酸化蛋白对应的总蛋白。举例来说，如果您想要检测ERK的磷酸化情况，那么除了运行ERK磷酸化抗体外，也需要同时进行ERK总蛋白的检测。仅通过磷酸化蛋白的表达变化来判断结果是不够准确的，只有磷酸化蛋白与总蛋白的比值发生变化，才能说明磷酸化水平发生了变化。

另外一个必要的内参是常用的控制蛋白，比如actin和GAPDH等。这些常规内参被用作实验体系的对照，确保样品加载量的一致性，从而排除实验体系本身可能带来的影响。