一、细胞冻存流程图
二、细胞冻存准备工作
准备好冻存管、离心管、移液管和移液器等必要耗材，将它们摆放整齐放置在超净台中，并打开紫外线灯照射30分钟。随后打开通风机让实验室通风3分钟。接着使用75%酒精擦拭操作台和双手以确保无菌。准备好冰盒，调节离心机至需要的转速。将细胞完全培养基、DMSO和胰酶等物品放入37摄氏度水浴箱中预热。
三、冻存步骤
1.取出细胞，用酒精消毒培养皿，然后放入超净台。
2.制备细胞冻存液：按照无血清培养基：血清：DMSO=7:2:1的比例配制细胞冻存液。【或者按照细胞特性，也可以选择供应商推荐的血清：DMSO=9:1的配方】。
3.按照细胞传代的步骤，对细胞进行消化和解离。
4.离心后，去掉上清液，用冻存液重新悬浮细胞。
5.可以使用细胞计数板或计数仪器对细胞进行计数，将细胞总数调整至每毫升5×10^5个细胞。
6.将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管，通常1-1.5毫升的细胞冻存悬液装入2毫升冻存管为宜。
7.放入专业的细胞冻存盒中，或者按照以下顺序进行冻存：-4℃30分钟 → 20℃30分钟 → 过夜于-80℃ → 液氮保存。
四、注意事项
1.选择在细胞旺盛分裂期进行冻存，确保细胞生长良好、致密度约为80-90%，活力达到90%以上。细胞活力差的情况下进行冻存，成活率很低。
2.选择试剂级DMSO，并通过0.22微米滤膜过滤。将其以5-10ml小体积分装，存放在4℃避光处，避免多次冻融。需要注意的是，DMSO不需要高压灭菌处理，反之可能会破坏其分子结构，降低冷冻保存效果。此外，在常温下，DMSO对人体有害，务必注意生物安全防护。
3.冻存液需提前配制，避免临时配制过程中产生的热量损伤细胞。
4.增加冻存液中血清的比例对保存某些脆弱的干细胞和其他珍贵细胞非常有益。
5.在用移液器吸取上清液时，避免吸到底部的细胞沉淀。
6.使用移液器轻柔搅动细胞，以避免损伤细胞。
7.混匀DMSO的过程应尽快进行，因为DMSO对细胞有毒性。混合后应立即进行冻存。
8.复苏细胞时应遵循快速解冻原则，以防止小冰晶形成大冰晶，即重结晶现象。而在细胞冻存时需要缓慢冷冻，使细胞逐步脱水，避免细胞内产生大冰晶造成伤害。对大多数细胞而言，每分钟降温1-3℃是适宜的速度。
