一、缓冲液建议

1.使用无钙/镁缓冲液。建议使用无钙/镁的PBS。这有助于减少细胞聚集。 

2.加入0.1-1%的BSA或1-5%的透析FBS。使用最少量的BSA以减少自发荧光并增加群体分辨率。避免使用非透析FBS，因为它会通过替换钙和镁来促进细胞间粘附。 

3.添加2-5mM的EDTA以帮助防止细胞粘附。 

4.分选过程中的高压会降低缓冲液的缓冲能力。加入10-25mM的HEPES以提高pH稳定性。 

5.对于细胞活力降低的样品，省略EDTA并添加25-50 ug/mL的DNAseI和5mM MgCl2。这会消化死细胞释放的游离DNA。

二、单细胞悬浮液

在分选前立即过滤。流式实验室应提供过滤器。处理组织样品时，将细胞通过25号针头。避免在处理过程中保持细胞不必要的过高浓度。根据细胞类型，在处理过程中将细胞悬浮液保持在1-10百万/mL。

三、死细胞鉴别

强烈建议在任何细胞分选实验中使用死细胞排除染料。这将大大减少自发荧光并降低非特异性基线，最终将增加群体分辨率。有多种染料可供选择，这些染料不会影响分选后功能分析。

四、物理操作

1.离心 ：使用最小速度沉降细胞。大多数样本的起始点是300xg离心10分钟。 

2.漩涡 ：避免剧烈漩涡。 

3.细胞团沉淀：在处理过程中任何时候都不要产生干沉淀。

4.气泡：避免引入气泡，表面张力会杀伤细胞。 

5.温度 ：除非特定实验要求，否则将样品保持在冰上。减慢细胞内代谢有助于细胞在培养箱外存活更长时间。

五、过滤器信息

1.一次性耗材：5mL管，带有35um网孔的盖子，Fisher目录号0877123 

2.可重复使用耗材：CellTrics 0400422316塑料过滤器、Elko 03-41/31 41um尼龙网。Alconox可洗涤塑料网，用水冲洗，从大卷上剪下的新尼龙网方块

六、补偿对照

1.细胞单染对照，阴性群也须是细胞。

2.补偿微球单染对照，则阴性群也须是微球（可单独阴性微球管，也可以是混合在阳性群的同一管里），并提供未染色的细胞对照。

七、门控对照

提供适当的门控对照。这对于单色分选也是必不可少的。

对于多色检测，强烈建议使用FMO。

可能需要额外的生物学对照以进行适当的门控，包括：阴性对照、阳性对照、模拟转染、处理过的、未处理的

八、样品交付

样品必须装在防漏管中，并在防漏容器和密封冷却中运输。 

细胞通常以大约10百万/mL的浓度分选，具体取决于细胞类型。 

如果样品中的细胞少于500万，请在300-500uL中重悬。 

准备额外的样品缓冲液（5-15mL）、FBS、收集缓冲液和收集管作为备份。 

使用适当的收集管（例如无菌、无RNAse）。

如有必要，为长时间分选准备额外的冰或干冰。

九、收集

1.恢复 ：少量的细胞应收集到小管中以获得最佳恢复。当细胞数量很少时，考虑直接收集到培养板或裂解缓冲液中。

2.活力 ：用蛋白涂覆管子以提高活力。避免使用空收集管！许多细胞不会耐受100% FBS。

3.标准格式管 ：微量离心管（1-多路分选） 、12x75mm 5mL管（1-多路分选）、15mL管（1-2路分选）、 

4.多孔板（1路分选）： 6、12、24、48、96或384孔 

5.定制格式 ：当在自定义设备（上述未列出的）上进行分选时，需提前用目标接收容器进行仪器调试。