通过使用荧光染料染色DNA并测量其强度，可以确定样本的细胞周期分布。染料与DNA的化学计量比染色，允许区分G0/G1期、S期和G2/M期的细胞，以及识别非整倍体细胞群体。各种染色流程可以适应不同类型的样本，但一般分析的原理和原则保持不变。

一、常用染料

1.一些DNA染料不染色活细胞。样本必须固定并渗透以允许染料进入细胞。

碘化丙啶（PI）- 蓝光/绿光激光，也染色RNA

DAPI - 紫外/紫光激光

2.一些DNA染料是膜透性的，可以用于染色活细胞。

Hoechst 33342 - 紫外/紫光激光

DRAQ5 - 红光激光

二、示例流程

1.收集细胞

2.用PBS重悬

3.逐滴加入冷乙醇，最终浓度为70%

4.在冰上固定至少两小时

5.用PBS洗涤

6.用染色缓冲液重悬（含100 µg/mL RNAseA、50 µg/mL PI的PBS，可选0.1% Triton X-100）

7.用箔纸包裹以避光

8.在4°C下孵育过夜

9.在流式细胞仪上采集数据

三、一致染色的技巧

1.计数细胞并计算细胞浓度

2.每个样本使用相同数量的细胞

3.使用过量的染料

4.过夜染色以达到平衡

5.在加入固定剂之前获得良好的单细胞悬浮液；一旦固定，聚集体就不能解离

四、样本考虑

细胞周期分析的最直接方法是用乙醇固定细胞，用RNase处理，并用PI染色。然而，某些实验可能需要不同的染色流程。

1.RNA的影响？PI除了DNA外还会染色RNA，所以细胞必须用RNase处理以准确分析细胞周期。使用DAPI时不需要RNase处理。

2.细胞可以是活的吗？穿透膜的染料无需渗透细胞。可能需要额外的试剂来抑制染料的泵出。请注意，这种染色和随后的激光照射可能会诱导细胞的DNA损伤反应。

3.哪种固定剂最好？醇类通常比交联固定剂产生更好的染色效果。然而，凋亡细胞中高度碎片化的DNA可能在没有交联的情况下丢失。

4.整个细胞还是核？一些流程要求溶解质膜。这减少了来自自发荧光或细胞质组分染色的测量变异性。请注意，核膜在有丝分裂期间崩溃，所以溶解质膜可以让此期间的染色体分散。

5.可以共染色吗？可以用荧光抗体标记细胞并分析DNA含量。一个选项是向现有的表面染色流程中添加一种膜透性DNA染料。或者，在表面染色后，进行温和的交联固定，渗透细胞，并添加DNA染料。

五、数据采集

G0/G1期细胞与G2/M期细胞之间的荧光强度最多相差两倍。因此，最好在线性尺度上查看DNA染色。除了前向散射和侧向散射外，还采集DNA通道的面积、高度和宽度参数。

六、标准参照

在确定新样本的倍性时，加入已知标准（如鸡红细胞核）可能很有用。ModFit LT等分析软件可以在拟合模型到数据时纳入这些标准。

七、评估数据质量

G0/G1峰的变异系数（CV）提供了测量准确性的指示。没有对此评估的普遍基准。然而，CV低于3%是理想的。超过6%通常被认为是差的。

八、变异来源

样本条件影响测量的准确性。这些因素包括：样本制备过程中的细胞损伤、细胞过多或染料过少、死细胞/垂死细胞过多

尽管竭尽全力实现最佳染色，但有些样本不会产生具有良好CV的数据。可能的因素包括：肿瘤中DNA含量的内在变异、通过损伤DNA、插入到螺旋中等改变DNA结构的药物处理、与DNA染料通过FRET相互作用的生色团处理、从石蜡块中分离得到的细胞核