石蜡切片的免疫荧光（Immunofluorescence on Paraffin Sections，简称IFPS）是将免疫学与荧光显微镜技术相结合，用于检测和定位组织切片中的特定蛋白质或抗原。该技术广泛应用于医学研究和诊断，尤其在肿瘤学、病理学和细胞生物学等领域具有重要价值。

一、实验原理

石蜡切片免疫荧光（IF-P）是一种应用于组织切片的免疫标记技术。在这项技术中，荧光物质（如荧光素）被标记于抗体上，然后将其与切片中的特定抗原结合。通过荧光显微镜观察，可以呈现出组织中特定分子的位置和分布情况。

IF-P技术可分为直接法和间接法两种。直接法是直接将荧光标记的一抗与目的蛋白结合，而间接法则是先将一抗与目的蛋白结合，再利用荧光标记的二抗进行检测。间接法是IF-P中最常用的方法，因其灵活性和灵敏度而受到青睐。

在实际操作中，进行IF-P实验需要先对组织样本进行固定、脱水和包埋等处理，然后进行切片。接着，样本经过抗原修复、蛋白阻断和抗体孵育等步骤，最终通过荧光显微镜观察并获得荧光信号。

 

二、实验仪器、耗材及试剂

组织包埋机、组织脱水机、切片机、摊片烤片机、荧光显微镜或共聚焦显微镜、摇床、微波炉、纯水机、粘附载玻片、盖玻片、组织包埋盒、免疫组化笔、抗原修复盒组合式染色缸、湿盒、吸水纸、镊子、毛刷、计时器、乙醇、二甲苯、石蜡、一抗、二抗、PBS缓冲液、柠檬酸盐抗原修复液、DAPI染色液、山羊血清、中性树脂等。

 

三、实验步骤

1.取材及固定

在进行石蜡切片的免疫荧光实验时，首先需要注意取材的重要性。选取想要观察的组织部位，并确保采集的材料是新鲜的，最好在处死动物后立即取材。长时间放置可能导致组织蛋白降解或理化性质改变，从而影响观察结果。固定组织的主要目的是保持其原有结构以便后续观察。

固定可以使用4%多聚甲醛进行，通常固定约24小时左右便可完成。然而，固定时间也会受到组织类型、大小、固定液种类等因素的影响，因此在具体操作时需根据情况进行调整。固定完成后，可以继续进行后续的抗原修复、蛋白阻断、抗体孵育等步骤，最终进行荧光显微镜观察，以获取组织中特定分子的定位和分布信息。

2.脱水

免疫荧光实验中的脱水步骤是非常关键的一步，它有助于有效地去除样品中的水分，使组织结构更加坚固，以确保后续处理过程中不会造成组织变形或破坏。脱水的适度是至关重要的，过度或不彻底的脱水都会对接下来的浸蜡和染色步骤产生负面影响。

通常在免疫荧光实验中，可以采用不同浓度的乙醇梯度来进行脱水处理。比如，可以先将样品依次置于75%乙醇中脱水4小时，接着转移到85%乙醇中脱水2小时，然后依次在90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中继续脱水，每一步骤的时间需要根据实际情况进行微调。

3.透明

透明有助于去除残留的脱水剂并使组织透明化，以便更清晰地观察和分析样品。透明的处理过程可以根据实际需要进行调整，虽然一般的操作顺序是无水乙醇与二甲苯的混合，但实际操作中也存在多种不同的方案。

通常，透明过程可以采用无水乙醇与二甲苯按照不同比例混合的方式进行。例如，可依次将样品放置在无水乙醇与二甲苯混合（1:1）的溶液中处理10分钟，接着转移到纯二甲苯中处理10分钟，然后继续进行二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ的处理步骤，每一步处理时间都要适当控制。

在实践中，不同的实验室可能会根据具体情况采用不同的透明处理方案，有些地方可能直接使用二甲苯进行透明处理，而有些则更倾向于采用混合处理以避免二甲苯挥发过快。此外，无水乙醇与二甲苯的混合比例也可能会因地区不同而异，有些地方可能会设置不同比例的混合梯度，例如2/3无水乙醇+1/3二甲苯、无水乙醇：二甲苯=1:1等，以满足实验的需求。

4.浸蜡

浸蜡的主要目的是使石蜡能够充分地进入组织，从而为后续的实验操作提供必要的支撑。通常情况下，选用熔点约在56℃~58℃范围内的石蜡进行浸蜡操作，以确保最佳效果（不同石蜡的熔点可能略有差异，应酌情调整浸蜡温度）。

为了确保浸蜡的充分性，一般建议进行三次浸蜡操作，每次持续1小时。这样的操作流程通常标记为石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，每一次浸蜡过程都至关重要，以保证样本组织能够充分地被石蜡所包裹和渗透。

5.包埋

在石蜡切片的免疫荧光实验中，包埋步骤是至关重要的环节。一旦浸蜡完成，将处理好的组织样本放入包埋盒中，并将熔化的石蜡倒入盒中。在将盒子小心置于冷台上待其冷却凝固的过程中，需格外小心谨慎，以防止组织在移动的过程中发生变形、折叠或损坏的情况发生。特别是对于小体积样本，操作时必须更加细心，以免由于疏忽而导致组织的丢失。

选择合适尺寸的包埋盒也至关重要，应根据组织的大小和形状进行选择，确保组织能够被完整包裹在其中。此外，在组织放置的过程中，也要注意组织的摆放方位，以确保后续的切片过程能够得到准确的结果。

6.切片及展片

切片及展片的步骤是非常关键的环节。首先，在切片前，需预先将蜡块冷却片刻以便更好地进行切片。调整切片机的厚度为较厚的层次（如：7 μm）进行修片，修片完成后建议更换刀片的位置以避免刀钝造成组织损坏，以确保切片质量。当能够清晰看到组织时，再将切片机的厚度调整至3 μm（常用石蜡切片厚度），以确保切出连续完整的组织片。

完成切片后，用毛刷轻轻沾取切好的片子，首先将其置于冷水中进行展片。随后，将片子转移至约42℃的温水中进行二次展片，确保组织能够平整展开，尽可能避免出现褶皱。

7.捞片及烤片

首先，使用镊子轻轻拨去多余的组织片，并利用报纸或其他较硬纸张轻轻带走水面上的碎片，确保样本表面清洁。接着，取出载玻片，在固定载玻片两侧面的同时，用中指辅助抵住载玻片背面以稳定载玻片的位置。将载玻片以适当的角度（约45°）斜插入水中，靠近组织片，等待组织片与载玻片接触后，轻轻提起载玻片即可完成捞片过程。

完成捞片后，将片子放置在约60℃的烤片机上烤片1小时。这个步骤至关重要，因为时间不足可能导致脱片，而时间过长则可能破坏组织结构。

8.脱蜡复水

首先，在二甲苯Ⅰ中处理组织10分钟，接着进行二甲苯Ⅱ的处理10分钟，然后进行二甲苯Ⅲ的处理10分钟，以确保充分去除蜡质。随后进行无水乙醇Ⅰ处理5分钟，继而进行无水乙醇Ⅱ处理5分钟，紧接着浸泡在95%酒精中3分钟，接着浸泡在90%酒精中3分钟，然后是80%酒精2分钟，70%酒精2分钟，随后进行蒸馏水Ⅰ处理3分钟，最后完成脱蜡复水过程的最后一步是蒸馏水Ⅱ处理3分钟。

9.抗原修复

抗原修复有助于恢复样本中的抗原性，提高实验的准确性和可靠性。为了配制柠檬酸盐抗原修复液（pH 6.0），可以采用微波炉进行如下步骤：首先将微波炉设置为中高火（80%火力）并加热样本液8分钟，然后停火静置8分钟，最后调至中低火（50%火力）再加热7分钟。待其自然冷却后，将样本用PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤5分钟。

10.封闭

完成清洗后，轻轻吸干水分后，可以利用组化笔在组织周围绘制一个圈，以确保后续试剂能够均匀地覆盖整个组织。接着，滴加山羊血清于室温下封闭1小时，这一步骤可以有效地阻断非特异性结合，提高抗体的特异性和灵敏度。封闭结束后，用PBS缓冲液进行3次洗涤，每次持续5分钟，以去除多余的血清和保证后续试剂的准确结合。

11.一抗孵育

首先需滴加适量一抗液覆盖整个切片组织，然后将切片置于4℃条件下进行孵育过夜。孵育结束后，通过使用PBS缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤时间为5分钟。

12.二抗孵育

滴加适量的荧光二抗液以覆盖整个组织，然后将切片放入暗盒内，置于避光条件下的室温孵育1小时（注意：之后的所有步骤均需在避光操作下进行）。孵育结束后，使用PBS缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤时间为5分钟。

13.DAPI染色

在进行石蜡切片的免疫荧光实验中，建议采用DAPI染液在避光条件下对样本进行染色处理，室温下染色时间为10分钟。随后，使用PBS缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤时间为5分钟。在完成洗涤后，轻轻蘸干水分，然后滴加抗荧光衰减封片剂，并盖上盖玻片。

14.观察

将样本放置在荧光显微镜或共聚焦显微镜下进行观察，以研究目的蛋白的分布情况。

注意事项

1.抗体选择：选择高特异性和高亲和力的抗体，尽量避免交叉反应。

2.抗原修复：根据目标抗原和组织类型选择合适的抗原修复方法和条件。

3.荧光标记：选择稳定性好、亮度高的荧光染料，以获得清晰的荧光图像。

 

五、应用

石蜡切片的免疫荧光广泛应用于以下领域：

1.肿瘤研究：检测肿瘤组织中的特异性标志物，了解肿瘤发生、发展和转移的机制。

2.疾病诊断：通过检测组织中的病理标志物，辅助疾病的诊断和分型。

3.细胞生物学：研究细胞中蛋白质的表达和定位，了解细胞功能和信号通路。