1. 宿主菌和表达载体的选择
宿主菌：通常选用巴斯德毕赤酵母（如GS115或KM71菌株），这些菌株具有强启动子（如AOX1启动子），适合高密度发酵和分泌表达外源蛋白。
表达载体：常用载体如pPIC9K，含有AOX1启动子、α-factor信号肽序列和多克隆位点，便于外源基因的插入和分泌表达。
2. 基因合成与质粒构建
基因优化：根据毕赤酵母的密码子偏好性，对人卵泡抑素基因（hFS）进行密码子优化，以提高表达效率。
质粒构建：将优化后的hFS基因克隆到表达载体中，构建重组质粒（如pPIC9K-hFS）。
3. 转化与筛选
转化方法：常用电穿孔法将线性化的重组质粒导入毕赤酵母感受态细胞。
筛选高拷贝转化子：利用抗生素（如G418）进行多拷贝筛选，获得高表达量的菌株。
4. 诱导表达
发酵条件：毕赤酵母在甲醇诱导下表达外源蛋白。发酵过程通常分为生长阶段（甘油培养）和诱导阶段（甲醇诱导）。
优化诱导条件：通过调整诱导温度、pH值、甲醇浓度等参数，提高hFS的表达量和活性。
5. 蛋白纯化与验证
纯化方法：由于毕赤酵母分泌表达的外源蛋白通常具有活性，可采用亲和层析（如Ni-NTA柱）、离子交换层析等方法进行纯化。
验证方法：通过SDS-PAGE、Western blot等技术验证hFS的表达和纯度。
6. 技术挑战与优化
基因整合效率：毕赤酵母的基因整合效率可能较低，需优化转化条件和筛选策略。
翻译后修饰：毕赤酵母的糖基化修饰与哺乳动物细胞不同，可能影响hFS的生物活性，需进一步验证。
表达量优化：通过多拷贝整合、启动子优化、发酵条件优化等手段提高hFS的表达量。
7. 应用前景
医学应用：hFS在生殖调控、细胞分化及代谢疾病治疗中具有重要应用价值，重组hFS的制备为其临床应用提供了可能。
工业化生产：毕赤酵母表达系统具有高表达量、易于放大培养等优点，适合hFS的工业化生产。
