一、操作说明

1.准备工作

清洁与消毒：使用超净工作台或生物安全柜，操作前需用75%乙醇擦拭台面，紫外线照射30分钟灭菌。

器具灭菌：培养瓶、移液管、离心管等需高温高压灭菌（121℃，20分钟）或使用一次性无菌器具。

试剂与水：使用分析纯试剂和超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm），避免杂质影响培养基质量。

2.培养基配制步骤

称量与溶解：

按配方准确称取固体成分（如氨基酸、维生素、无机盐等），加入适量超纯水，搅拌至完全溶解。

示例：配制1 L DMEM培养基时，需称取DMEM粉末13.4 g，加入800 mL水，搅拌至无颗粒。

调节pH值：

使用1 M NaOH或1 M HCl调节pH至目标值（如DMEM为7.2-7.4）。

操作技巧：缓慢滴加酸碱溶液，边加边搅拌，用pH计实时监测，避免pH值波动过大。

定容与过滤：

将溶液转移至容量瓶，定容至刻度线，混匀。

使用0.22 μm滤膜过滤除菌，确保培养基无菌。

分装与保存：

将培养基分装至无菌容器中，密封后保存于4℃冰箱（液体培养基）或-20℃（粉末或浓缩液）。

3.添加特殊成分

血清与抗生素：

血清（如FBS）需在56℃水浴中灭活30分钟，以去除补体活性。

添加抗生素（如青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL）时，需确保浓度符合实验要求。

生长因子与添加剂：

需在培养基灭菌后添加（如L-谷氨酰胺、去甲肾上腺素等），避免高温破坏活性。

 

二、注意事项

1.无菌操作

全程佩戴无菌手套、口罩，避免直接接触培养基或器具。

火焰灭菌：镊子、移液管等金属器具需在酒精灯火焰上短暂灼烧灭菌。

避免交叉污染：不同培养基或细胞系需使用独立器具，防止交叉污染。

2.pH值控制

pH值对细胞生长至关重要，需根据细胞类型调整（如CHO细胞偏好pH 7.0-7.2，而HEK293细胞偏好pH 7.4）。

调节pH时需缓慢加入酸碱溶液，避免局部浓度过高导致沉淀。

3.灭菌与保存

液体培养基灭菌后需冷却至室温再添加血清等热敏成分。

培养基保存时间：含血清的培养基建议在2-4周内使用，避免营养成分降解。

避免反复冻融：分装成小份保存，减少冻融次数。

4.质量控制

无菌检测：取少量培养基接种至LB平板，37℃培养24-48小时，观察有无菌落生长。

pH值复核：使用pH计或pH试纸再次确认培养基pH值是否符合要求。

渗透压检测：使用渗透压计检测培养基的渗透压（如DMEM的渗透压通常为280-320 mOsm/kg）。

5.常见问题处理

沉淀或浑浊：可能因pH值不当或盐类析出，需重新调节pH并过滤。

细胞生长缓慢：检查血清质量、抗生素浓度或培养基成分是否过期。

污染问题：若发现细菌或真菌污染，需立即丢弃污染培养基，并对环境进行彻底消毒。

 

三、常见培养基配方示例（以DMEM为例）

成分	用量（1 L）	作用
DMEM粉末	13.4 g	提供基础营养
NaHCO₃	3.7 g	调节pH值
青霉素	100 U/mL	抑制细菌生长
链霉素	100 μg/mL	抑制细菌生长
胎牛血清（FBS）	100 mL	提供生长因子和营养物质

操作步骤：

将DMEM粉末和NaHCO₃溶于800 mL超纯水中，搅拌至完全溶解。

用1 M HCl或1 M NaOH调节pH至7.2-7.4。

定容至1 L，过滤除菌。

加入FBS和抗生素，混匀后分装保存。

 

四、总结

配制培养基需严格遵循无菌操作、精准称量、科学调节pH和合理保存等原则。通过规范操作，可确保培养基质量，为细胞培养提供稳定的环境。在实际操作中，需根据细胞类型和实验需求调整培养基配方，并定期进行质量控制，以保障实验结果的可靠性和重复性。