一、选择合适的转染方法
传统脂质体法转染效率低且细胞毒性高，常规电穿孔设备易导致细胞膜不可逆损伤。针对活体T细胞膜电荷特性，可采用威尼德Gene Pulser 830方波型电穿孔仪的极性反转技术，突破细胞膜电荷屏障，提高转染效率。
二、优化转染试剂与核酸保护体系
1.转染试剂：选择适合的转染试剂，并配合优化核酸保护体系，建立高效低毒的转染方案。
2.siRNA预混：将靶向基因的siRNA与转染增强剂按一定体积比预混，孵育形成复合物，再用于转染。
三、优化电穿孔参数
1.脉冲模式：采用双极性方波，设置正向脉冲时间和反向脉冲时间，以优化转染效果。
2.电压梯度：进行多组电压梯度对比实验，如800V/cm、1000V/cm、1200V/cm，选择最佳电压梯度。
3.智能阻抗检测：利用预脉冲自动校准细胞悬液导电率，降低批次间差异。
4.极性反转技术：突破活化T细胞表面电荷极化效应，提高转染效率。
四、确保细胞状态良好
1.细胞分离与活化：使用Ficoll密度梯度离心分离PBMC，再用CD3磁珠分选获得纯度高的T细胞，于含IL-2的培养基中活化。
2.细胞密度：根据转染试剂的要求，选择合适的细胞密度进行转染。例如，某些转染试剂要求细胞密度在30%-50%之间，而另一些则要求在70%左右。
五、设置对照组与检测指标
1.对照组设置：设置阴性对照（如scrambled siRNA）及空白对照，以评估siRNA转染的特异性效应。
2.检测指标：
内吞效率：使用流式细胞术检测FITC标记siRNA的内吞效率。
基因抑制率：通过qPCR定量检测目标基因mRNA的抑制率。
细胞活性：采用CCK-8法测定转染后细胞的活性。
六、验证转染效果与沉默持续性
1.转染效率与细胞活性验证：通过实验验证转染效率和细胞活性，确保转染方案的有效性。
2.沉默效果持续性观察：观察转染后基因沉默效果的持续时间，如CD25 mRNA表达下调和蛋白表达抑制率的持续时间。
