一、抗原准备

1.抗原选择

蛋白抗原：纯化目标蛋白，确保其纯度>90%（如重组蛋白、天然蛋白）。

多肽抗原：根据目标蛋白的保守区域或功能区设计多肽，长度通常为10-20个氨基酸，并偶联载体蛋白（如KLH、BSA）以提高免疫原性。

核酸抗原：适用于病毒或基因治疗研究，需通过体外转录或合成获得。

2.抗原纯化与修饰

使用亲和层析、离子交换层析等方法纯化抗原。

对于多肽抗原，需通过化学偶联（如戊二醛法、马来酰亚胺法）将其与载体蛋白偶联，增强免疫原性。

3.抗原浓度与佐剂选择

抗原浓度通常为0.1-1 mg/mL。

4.佐剂选择：初次免疫使用完全弗氏佐剂（CFA），加强免疫使用不完全弗氏佐剂（IFA），以增强免疫应答。

 

二、动物免疫

1.动物选择

常用实验动物包括兔子、小鼠、大鼠、山羊等。

选择依据：抗原来源（避免同源性免疫耐受）、抗体需求量及实验预算。

2.免疫程序

初次免疫：将抗原与CFA等体积混合，乳化后进行多点皮下或肌肉注射（如兔子背部多点注射，每点0.1 mL）。

加强免疫：初次免疫后2-4周进行，使用IFA与抗原混合，剂量与初次免疫相同。

免疫次数与间隔：通常进行3-4次加强免疫，间隔2-3周，最后一次免疫后7-10天采血。

3.免疫效果监测

通过ELISA或Western blot检测血清抗体效价，当效价达到1:10,000以上时，可进行采血。

 

三、血清采集与处理

1.采血方法

心脏采血：适用于大动物（如兔子、山羊），可获得大量血清。

尾静脉采血：适用于小鼠等小动物，适用于少量血清需求。

2.血清分离与保存

采血后，将血液置于37℃温育1小时，再于4℃静置过夜，离心（3000 rpm，10分钟）分离血清。

血清分装后，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

 

四、抗体纯化

1.饱和硫酸铵沉淀法（粗提）

将血清与等体积生理盐水混合，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度50%，4℃沉淀2小时。

离心（10,000 rpm，30分钟）收集沉淀，重悬于PBS中，透析去除硫酸铵。

2.亲和层析纯化（高纯度）

Protein A/G亲和层析：适用于IgG类抗体，通过柱层析纯化，洗脱液为酸性缓冲液（如0.1 M甘氨酸-HCl，pH 2.7），立即中和至中性。

抗原亲和层析：将抗原偶联至琼脂糖凝胶，通过特异性结合纯化多抗。

3.纯度验证

通过SDS-PAGE检测抗体纯度，应呈现单一重链（50 kDa）和轻链（25 kDa）条带。

 

五、抗体鉴定

1.效价测定

采用ELISA法，将抗原包被于酶标板，加入梯度稀释的抗体，通过HRP标记的二抗检测，以OD值≥1.0时的最高稀释度为抗体效价。

2.特异性验证

Western blot：检测抗体能否特异性识别目标蛋白。

免疫组化/免疫荧光：验证抗体在组织或细胞中的定位特异性。

3.交叉反应性测试

通过Western blot或ELISA检测抗体是否与非目标蛋白发生交叉反应，确保特异性。

 

六、抗体保存与使用

1.保存条件

短期保存（<1个月）：4℃（添加0.02% NaN₃防腐）。

长期保存：分装后-20℃或-80℃（避免反复冻融）。

冻干保存：将抗体与蔗糖等保护剂混合后冻干，室温可保存数年。

2.使用建议

抗体工作浓度需通过预实验优化，通常为1:500-1:5000。

避免使用含叠氮钠的缓冲液稀释抗体，以免影响后续实验（如细胞实验）。

 

七、注意事项

1.伦理与动物福利

遵守动物实验伦理规范，减少动物痛苦，如采用无痛采血技术。

2.抗原表位多样性

多抗可识别多个表位，适用于检测天然构象蛋白，但可能因表位遮蔽导致假阴性。

3.批次间差异

多抗制备存在批次间差异，建议同时制备多只动物血清，混合后使用以降低差异。

 

总结

多抗制备的核心在于抗原设计、免疫程序优化和抗体纯化。通过合理选择抗原、调整免疫方案和采用高效纯化方法，可获得高特异性、高亲和力的多抗。多抗在基础研究、诊断试剂开发等领域具有广泛应用，但需注意其批次间差异和交叉反应性。在实际操作中，建议结合ELISA、Western blot等验证方法，确保抗体的质量和特异性。